IL－1β和IL－6對椎間盤髓核細胞NGF表達的影響*

王 剛，韓敦富，施彥璋，陳志維，李逸群，劉尚禮△

(1佛山市中醫院骨科，廣東 佛山 528000;2中山大學附屬第二醫院骨科，廣東 廣州 510120;3汕頭市中心醫院骨科，廣東 汕頭 515031)

源于椎間盤的腰痛仍是目前社會中嚴重影響人們生活和致殘的常見原因之一[1]，研究表明，傷害感受器神經纖維的長入可能是導致椎間盤源性腰痛發生的基礎[2，3]，神經生長因子 (nerve growth factor，NGF)在促進神經纖維長入椎間盤過程中可能起到了關鍵作用[4]。研究還發現腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)－α，白細胞介素(interleukin，IL)－1β等在退變椎間盤中高表達[5]，并且可以大大提高椎間盤細胞分泌 NGF[6，7];進一步研究表明，IL－6、IL－8在疼痛的椎間盤高表達，而TNF－α、IL－1β則表達較低[8]。因此，我們推測 IL－6、IL－8等在促進椎間盤細胞產生NGF，誘導神經長入過程中可能發揮了更重要的作用。因此，本文目的旨在觀察IL－1β和IL－6對體外培養的人椎間盤髓核細胞NGF表達的影響。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 DMEM－F12培養基(Gibco)，胎牛血清(Hyclone)，IL－1β 及 IL－6(Peprotechec)，Trizol(Invitrogen)，逆轉錄多聚酶鏈反應 (reverse transcription polymerase chain reaction，RT－PCR)試劑盒(TaKaRa)，PCR引物(上海生工生物工程技術服務有限公司)，蛋白裂解液 (申能博彩，進口分裝)，β －actin、NGF－β 單克隆抗體(Newmarker)，Ⅱ型膠原單克隆抗體(Chemicon)，羊抗兔Ⅱ抗(晶美生物有限公司)，增強化學發光液(enhanced chemiluminescence，ECL)(晶美生物有限公司)。

1.2 人髓核細胞來源 將取自特發性脊柱側彎患者的髓核組織標本進行分離培養，男女各2例，年齡在10－15歲之間，L2/L3節段2例，L3/L4節段2例，所取節段椎間盤術前MRI顯示Pfirrmann退變分級[8]為 1 級。

2 方法

2.1 髓核細胞的分離和培養 前路手術取出椎間盤組織后立刻裝入50 mL無菌離心管，置于冰盒后即刻送往實驗室。椎間盤組織用冰磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)溶液漂洗3次，分離出中央膠凍樣髓核組織，在DMEM/F12培養基中將其剪成約1 mm×1 mm×1 mm的組織顆粒，1000 r/min離心5 min，去上清液，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基(含青、鏈霉素各1×105U/L)重懸后轉移到15 mL離心管中，在37℃、5%CO2培養箱中培養8 h，然后離心去上清，PBS漂洗后，依次用0.25%胰蛋白酶、2%Ⅱ型膠原酶消化后，收集上清液，1000r/min離心 5 min，去除上清液，再加入10 mL含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基吹打均勻后計數，以3×105cells/cm2濃度轉移到6孔培養板或25 cm2培養瓶在37℃、5%CO2培養箱中培養備用。細胞貼壁后，每2－3 d換液1次，按時用倒置顯微鏡觀察、拍照。

2.2 髓核細胞鑒定 制備好細胞爬片，用新鮮配制的4%多聚甲醛固定20 min。甲苯胺藍染色觀察細胞糖胺多糖的分泌能力:將固定好的細胞爬片，10 g/L甲苯胺藍室溫染色10 min，光學顯微鏡觀察拍照。番紅－O染色觀察蛋白多糖的分泌能力:將固定好的細胞爬片，用1%番紅－O室溫浸染30 min，光鏡下觀察拍照。Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色確定Ⅱ型膠原分泌情況:將固定好的細胞爬片，3%H2O2甲醇溶液滅活內源性過氧化物酶10 min，正常山羊血清室溫封閉20 min，滴加1∶150稀釋的Ⅱ型膠原單克隆抗體，4℃孵育過夜，滴加生物素化Ⅱ抗，37℃孵育20 min，滴加SABC試劑 37℃ 20 min，滴加新鮮配制的DAB顯色劑，鏡下控制顯色。并設置陰性對照組。沖洗、脫水、封片，光鏡下觀察拍照。

2.3 IL－1β、IL－6和髓核細胞共培養 細胞培養7 d后，更換無血清培養基繼續培養24 h，分別設置對照組和實驗組，更換為含0.3% 胎牛血清的DMEM/F12 培養基，實驗組中分別加入(10 μg/L、50 μg/L)IL－1β、IL－6共培養48 h，分別應用免疫組織化學法、RT－PCR和Western blotting檢測細胞表達NGF的情況。

2.4 IL－1β、IL－6和髓核細胞共培養后 NGF表達的檢測

①免疫組織化學法檢測髓核細胞NGF的表達情況步驟同Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色。

②RT－PCR檢測髓核細胞NGF mRNA的表達 共培養48 h時棄去上清液，加入Trizol提取總RNA，采用TaKaRa PrimeScriptTMRT－PCR kit試劑盒二步法RT－PCR檢測 NGF mRNA的表達。NGF－β、磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH)上、下游引物序列及產物長度見表1，擴增產物以2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統進行拍照，MacintoshⅡ圖像分析軟件進行吸光度掃描分析，以目的條帶吸光度與內參照GAPDH吸光度比值表示目的基因表達水平。

表1 NGF－β、GAPDH上、下游引物序列及產物長度Table1.The primer and the length of NGF and GAPDH

③Western blotting檢測髓核細胞NGF蛋白表達 共培養48 h時棄去上清液，加入蛋白裂解液提取總蛋白，制備樣品并配置SDS(sodium－dodecyl sulphate)－PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)凝膠，行SDS－PAGE凝膠電泳，將蛋白質電轉移聚乙烯二氟

(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜和膜封閉，封閉結束后，孵育Ⅰ抗4℃過夜(NGF－β和β－actinⅠ抗稀釋度均為1∶1000)，1×PBST洗滌3次，每次5 min，室溫孵育Ⅱ抗(稀釋度1∶1000)1 h。將 ECL發光試劑涂于PVDF膜上，反應1－3 min，置于暗盒中使X光膠片曝光2－30 min，顯影定影，照像留底。用MacintoshⅡ圖像分析系統計算分析條帶的灰度值，用NGF－β與相應β－actin條帶值的比值反映β－NGF表達的變化。

3 統計學處理

結 果

1 髓核細胞鑒定

自髓核組織中分離和培養出的髓核細胞，可被甲苯胺藍、番紅－O深染色，具有分泌糖胺多糖和蛋白多糖能力;Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色確定該類型細胞可分泌Ⅱ型膠原，見圖1。

Figure1.The identification of nucleus pulposus cells(×200).A:the staining of toluidine blue;B:the staining of safranine－O;C:immunocytochemical staining of collagen－II.圖1 髓核細胞的鑒定

2 髓核細胞和IL－1β、IL－6共培養后NGF表達情況

2.1 髓核細胞NGF表達的免疫組織化學檢測 各組中髓核細胞細胞質中均出現彌散的淡黃染色，分別和IL－1β、IL－6共培養后的髓核細胞彌散的淡黃染色稍增多，見圖2。

2.2 IL－1β、IL－6對髓核細胞 NGF mRNA 表達的影響 髓核細胞分別和不同濃度的IL－1β、IL－6共培養48 h后，提取總RNA行RT－PCR檢測NGF mRNA表達，結果顯示:與對照組比較，10 μg/L、50 μg/L IL－1β組分別上調了髓核細胞NGF mRNA的表達約2.6、2.8 倍，而10 μg/L、50 μg/L IL －6 組分別上調了約3.6、4.1倍，見圖3、表2。

Figure2.Immunocytochemical staining of NGF in nucleus pulposus cells(×200).A:control;B:stimulated by IL－1β (50 μg/L);C:stimulated by IL －6(50 μg/L).圖2 髓核細胞NGF免疫組織化學染色

2.3 IL－1β、IL－6對髓核細胞 NGF蛋白表達的影響 共培養48 h后提取總蛋白用Western blotting檢測NGF蛋白表達結果顯示:與對照組比較，10 μg/L、50 μg/L IL－1β組分別上調了髓核細胞NGF蛋白的表達約5.4、5.8 倍，而10 μg/L、50 μg/L IL －6 組分別上調了約7.4、8.0倍，結果和RT－PCR檢測的NGF mRNA表達結果相一致，見圖4、表2。

Figure3.The expression of NGF mRNA in the nucleus pulposus cells after IL－1β or IL－6 stimulation.1:control;2:10 μg/L IL － 1β;3:50 μg/L IL － 1β;4:10 μg/L IL －6;5:50 μg/L IL －6.圖3 IL－1β、IL－6對髓核細胞NGF mRNA表達的影響

Figure4.The expression of NGF protein in the nucleus pulposus cells after IL－1β or IL－6 stimulation.1:control;2:10 μg/L IL － 1β;3:50 μg/L IL － 1β;4:10 μg/L IL －6;5:50 μg/L IL －6.圖4 IL－1β、IL－6對髓核細胞NGF蛋白表達的影響

表2 IL－1β、IL－6對髓核細胞NGF mRNA及蛋白表達的影響Table2.The expression of NGF mRNA and protein in the nucleus pulposus cells after IL－1β or IL－6 stimulation(.n=3)

表2 IL－1β、IL－6對髓核細胞NGF mRNA及蛋白表達的影響Table2.The expression of NGF mRNA and protein in the nucleus pulposus cells after IL－1β or IL－6 stimulation(.n=3)

＊＊P ＜0.01 vs control group;△△P ＜0.01 vs IL－1β.

Group NGF mRNA NGF protein Control 1.00 ±0.10 1.00 ±0.20 IL －1β10 μg/L 2.60 ±0.26＊＊ 5.40 ±0.30＊＊IL －1β 50 μg/L 2.80 ±0.25＊＊ 5.80 ±0.28＊＊IL －610 μg/L 3.60 ±0.22＊＊△△ 7.40 ±0.40＊＊△△IL －650 μg/L 4.10 ±0.23＊＊△△ 8.00 ±0.45＊＊△△

討 論

椎間盤為“三明治”結構，上下為軟骨終板，與上下方椎體相連，中間部分的內外層分別為髓核和纖維環。正常人類椎間盤除纖維環的外1/3存在血管神經外基本是一個不含神經血管組織，然而研究發現，在疼痛椎間盤中，微血管伴隨神經末梢通過終板長入正常無血管的椎間盤內部[2，3]。Peng 等[2]的研究發現，椎間盤源性腰痛病人椎間盤中，新生的神經纖維和毛細血管沿椎間盤裂隙的肉芽組織長入纖維環和髓核，這種神經纖維的長入以及神經分布密度的增加可能是椎間盤源性疼痛的解剖基礎。

與感受疼痛相關的神經元分為NGF依賴性神經元和膠質細胞源性神經營養因子(glial cell line－derived neurotrophic factor，GDNF)依賴性神經元。NGF依賴性神經元表達P物質(substance P，SP)及降鈣素基因相關肽(calcitonin gene－related peptide，CGRP)，與炎癥疼痛相關;GDNF依賴性神經元表達結合凝集素B4，與各種疼痛如神經損害相關的神經性疼痛有關。在人類椎間盤中感覺神經元是表達CGRP神經元纖維，未發現結合凝集素B4神經元纖維，椎間盤感覺神經纖維主要是與炎癥疼痛相關的包含神經肽的 NGF依賴性小神經元[9，10]。NGF在疼痛椎間盤中的表達較在無癥狀的椎間盤中明顯增加，且存在表達NGF受體TrkA的神經纖維和微小血管[1，2]。NGF 能支持神經元存活，促進其生長、分化，維持其功能[11]，對NGF起反應的神經元主要有交感神經元、感覺神經元和中樞膽堿能神經元，NGF由這些神經元的靶組織產生，被神經元的軸突末梢攝取，籍逆運行運輸到胞體，為這些神經元的存活和維持所必需，所以，NGF是典型的靶源性神經營養因子。體外培養實驗證實背根神經節細胞軸突生長依賴于髓核細胞分泌的NGF[12]，提示髓核細胞產生的NGF可能是神經長入退變的椎間盤啟動因素。

NGF具有營養神經和致敏傷害感受器的作用，在炎癥組織中NGF的合成明顯增加[13]。致炎因子IL－1β和TNF－α已被確定與椎間盤退變有明確關系[5]，且可誘發椎間盤細胞分泌 NGF[6，7]，從而誘導神經纖維的長入和致敏椎間盤感覺神經末梢而導致盤源性腰痛的發生。然而，Burke等[8]研究顯示椎間盤源性腰痛患者的椎間盤中促炎因子IL－6、IL－8、PGE的表達比不伴腰痛的坐骨神經痛腰椎間盤突出患者明顯增高，卻未檢測到IL－1β和TNF－α的表達。進一步的研究顯示，IL－6、IL－8在退變的椎間盤中表達明顯升高，而IL－1β和TNF－α則在椎間盤突出周圍的肉芽組織中高表達[14]。因此，我們推測IL－6、IL－8等因子在導致椎間盤源性腰痛的發生發展過程中可能起到了重要作用，但其是否通過提高椎間盤細胞分泌NGF進而誘發了一系列反應這一具體機制，有待進一步研究。

本研究發現IL－1β、IL－6均可增強體外培養的人髓核細胞產生NGF的能力，同等濃度下IL－6具有更強的上調作用。但IL－1β、IL－6在正常和退變人椎間盤中的表達量尚需進一步確定以明確其在何種濃度下何者發揮了更重要的作用。結合以往文獻，這一結果說明IL－6等因子可能通過提高椎間盤細胞分泌NGF，從而誘導神經纖維長入椎間盤而導致盤源性腰痛的發生。

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