虎杖苷抑制ox－LDL誘導的脂質過氧化并下調巨噬細胞清道夫受體CD36表達*

肖銘甲，陳衛紅，吳 煒，郭 文，趙克森，趙 明△

(南方醫科大學1第一臨床醫學院，2基礎醫學院病理生理教研室，廣東省休克微循環重點實驗室;3南方醫院消化科，廣東省胃腸疾病重點實驗室，廣東 廣州 510515)

動脈硬化引起的心腦血管疾病嚴重危害人類身體健康，是人類兩大致死原因之一。動脈硬化發生的早期表現是巨噬細胞大量吞噬氧化的低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)形成泡沫細胞。在泡沫細胞的形成中，巨噬細胞脂代謝失調有重要的作用[1]。正常的巨噬細胞，有一個脂代謝的負反饋調節機制。它經過LDL受體吞噬LDL;而當細胞內脂質合成或吞噬的脂質過量時，LDL受體的表達和膽固醇的合成又會得到抑制，從而保護巨噬細胞避免泡沫樣變。氧化的低密度脂蛋白(oxidized LDL，ox－LDL)的作用則不同，它激活和誘導巨噬細胞表達清道夫受體，其中以CD36為主;經清道夫受體吞噬ox－LDL，沒有脂代謝的負反饋調節機制，使巨噬細胞大量吞噬脂質從而泡沫樣變，泡沫細胞在動脈壁聚集，形成動脈硬化斑塊。

動脈硬化的發生率在西方約為2‰，而發展中國家的發生率，約為萬分之四左右。西方的膳食結構是這個差別的主要原因。在西方國家中法國卻是一個例外。盡管法國人也是西方的膳食結構，但是，法國冠心病死亡率只有美國的三分之一，稱為法蘭西矛盾現象(French paradox)，它與法國人喜飲葡萄酒的習慣有關。進一步的研究發現是由于葡萄皮中富含白藜蘆醇的緣故[2]。白藜蘆醇被證明是一種有效的抗氧化劑，它廣泛存在于葡萄、花生等72種植物中。中草藥中以虎杖含量最高。虎杖的提取物－虎杖苷，已經被證明具有抗休克作用，作為國家I類新藥，已經進入二期臨床實驗。近年來，關于虎杖苷的降血脂、抗氧化功效也逐漸引起關注。明確虎杖苷降血脂以及抗氧化的機制無疑對抗衰老和預防動脈粥樣硬化具有十分重要的意義。因此我們利用分子探針和流式細胞儀等手段和儀器，研究了虎杖苷抗氧化的機制和抑制巨噬細胞清道夫受體表達的效果，為虎杖苷在臨床應用的進一步擴大，提供理論依據。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 雌性SPF級C57/BL6小鼠(18－22 g)，購自南方醫科大學實驗動物中心。

1.2 儀器 水平電泳儀(Bio－Rad)、流式細胞儀(R＆D)、低溫超速離心機(Beckman)、恒溫水浴箱(北京)、超凈操作臺(蘇州)。

1.3 試劑 虎杖苷由深圳海王藥業集團提供;普通人血漿購自南方醫院血庫;解離緩沖液(dissociation buffer)、CD36抗體、二氫羅丹明(dihydrorhodamine 123，DHR123)均購自Sigma;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、脂質過氧化物(lipid peroxide，LPO)檢測試劑盒均購自南京建成生物有限公司;其余試劑均為國產分析純。

2 方法

2.1 LDL的分離與氧化修飾 用1次性密度梯度超速離心法(60000 r/min，6 h)從人血漿中分離LDL，測得蛋白濃度0.4 g/L[3]。LDL經透析膜去除溴化鈉(NaBr)后，置于含5 μmol/L Cu2+的PBS中，37℃溫育8 h。修飾后的 LDL加入 200 μmol/L EDTA終止反應。PBS透析24 h去除EDTA，超濾除菌后4℃保存[4]。修飾程度鑒定采用瓊脂糖凝膠電泳法。

2.2 動物分組及處理 將虎杖苷用生理鹽水配成1.5%的溶液，小鼠腹腔注射0.2 mL/d，對照組注射等量生理鹽水，連續注射3 d，第4 d停止注射，第5 d眼球取血處死，75%乙醇消毒，取腹腔巨噬細胞培養備用。

2.3 細胞培養 將提取的小鼠腹腔巨噬細胞以1×106cells/well的密度接種入24孔板，用含10%胎牛血清的DMEM培養液培養。

2.4 SOD檢測 小鼠腹腔巨噬細胞，離心后超聲粉碎，再離心，根據SOD試劑盒(南京建成生物有限公司)說明書要求，取細胞裂解液的上清，采用黃嘌呤氧化酶法，測定細胞SOD。

2.5 LPO檢測 將提取并培養的巨噬細胞給予ox－LDL(50 mg/L)刺激4 h，離心取上清并按照LPO試劑盒(南京建成生物有限公司)說明書，應用硫代巴比妥酸(thibabituric acid，TBA法)，檢測細胞LPO。

2.6 流式細胞儀檢測呼吸爆發 小鼠腹腔巨噬細胞接種于培養基，培養12 h后洗去未貼壁細胞，向培養基加ox－LDL(50 mg/L)，刺激15 min，PBS沖洗終止刺激，用dissociation buffer洗脫細胞，清洗后用10μmol/L二氫羅丹明(DHR123)處理細胞，流式細胞儀檢測呼吸爆發。

2.7 流式細胞儀檢測CD36 小鼠腹腔巨噬細胞接種于培養基，培養12 h后洗去未貼壁細胞，向培養基加ox－LDL(50 mg/L)。培養24 h后，用 dissociation buffer洗脫細胞，清洗后用FITC－CD36抗體標記，流式細胞儀檢測誘導情況。

3 統計學處理

用GraphPad軟件對結果進行單向方差分析，數據用均數±標準差()表示。

結 果

1 虎杖苷提高小鼠腹腔巨噬細胞SOD的活性

如圖1所示，虎杖組的巨噬細胞的SOD明顯高于PBS組(P＜0.01)。

Figure1.Polydatin up－regulated SOD activity in peritoneal macrophages.5 ×105abdominal macrophages from indicated groups were isolated separately.SOD activities in supersonic lycate were assayed as described in the materials and methods section..n=6.*P＜0.05 vs PBS group.圖1 虎杖苷顯著提高巨噬細胞SOD活性

2 虎杖苷抑制ox－LDL誘導的小鼠腹腔巨噬細胞呼吸爆發

圖2A為銅離子修飾的低密度脂蛋白凝膠電泳結果。可見氧化修飾的低密度脂蛋白由于攜帶負電荷增加，在電場中向正極移動得較快。正常低密度脂蛋白的條帶與正常小鼠血漿中的低密度脂蛋白條帶重合，見圖2A。圖2B示ox－LDL的自由基代謝產物MDA增加，與正常的LDL有顯著區別。圖2C顯示，ox－LDL誘導巨噬細胞呼吸爆發，而虎杖苷可以抑制這個呼吸爆發的發生，它與PBS對照組沒有顯著差異。

3 虎杖苷抑制ox－LDL誘導的小鼠腹腔巨噬細胞LPO的蓄積

如圖3所示，PBS處理組的LPO蓄積較少，而給予ox－LDL刺激后，細胞的LPO蓄積明顯增多，提示細胞的氧化應激程度較高;而虎杖注射組的巨噬細胞培養液LPO蓄積低于ox－LDL刺激組。

4 虎杖苷抑制ox－LDL誘導的小鼠腹腔巨噬細胞CD36的表達

圖4顯示，PBS處理組巨噬細胞表達的CD36水平較低，在給予ox－LDL刺激后，CD36表達明顯增多;而虎杖苷可有效抑制ox－LDL誘導的CD36表達(PBS+ox－LDL:91.44±9.07 vs虎杖苷+ox－LDL:49.52 ±2.01)。

Figure2.Polydatin inhibited ox－LDL－induced respiratory burst in peritoneal macrophages.A:agarose gel electrophoresis result from Cu2+－induced oxidation of LDL.B:MDA assay in ox－LDL..n=6.△P＜0.05 vs PBS group.C:5×105abdominal macrophages were incubated with 50 mg/L ox－LDL for 15 min，cells from control group were incubated in standard cultue condition.DHR123 staining was assayed by flow－cytometry..n=6.#P＜0.05 vs PBS group;*P＜0.05 vs PBS+ox－LDL group.圖2 虎杖苷抑制ox－LDL誘導巨噬細胞呼吸爆發

討 論

巨噬細胞的呼吸爆發(respiratory burst)主要是經兩大途徑產生超氧陰離子，一是激活細胞內NADPH氧化酶，一是破壞線粒體，造成線粒體損傷，線粒體內的高能電子滲漏，釋放自由基[5]。氧化的LDL可以循清道夫受體及TLR2、TLR4等受體信號轉導途徑，激活NADPH氧化酶在胞漿中的亞基，例如磷酸化p47phox，從而使在胞漿內的亞基遷移到質膜上，組裝成完整的酶復合體，發揮作用。NADPH氧化酶可以被看成是與質膜結合的微小電子傳遞鏈，它能夠將分子氧通過單電子還原產生過氧化自由基()，并以此為基礎形成一系列二級產物，這些產物通稱活性氧(reactive oxygen species，ROS)。

Figure3.Polydatin significantly reduced ox－LDL－induced LPO accumulation in peritoneal macrophages.5×105 abdominal macrophages from indicated groups were isolated，and cultured with 50 mg/L ox－LDL for 4 h.Cells in PBS control group were cultured in standard condition.Cell supernatants were assayed for LPO according to manufactures instruction(see materials and methods section)..n=6.△P＜0.05 vs PBS group;*P ＜0.05 vs PBS+ox－LDL group.圖3 虎杖苷明顯降低ox－LDL誘導的巨噬細胞LPO蓄積

Figure4.Polydatin inhibited ox－LDL－induced CD36 expression.5×105abdominal macrophages from indicated groups were incubated with 50 mg/L ox－LDL for 24 h.Cells in PBS control group were under standard culture condition.CD36 expression was assayed by flow－cytometry..n=6.#P＜0.05 vs PBS group;*P＜0.05 vs PBS+ox－LDL group.圖4 虎杖苷下調ox－LDL誘導的巨噬細胞CD36表達增高

Figure5.Schematic diagram for the inhibitory target of polydatin in ox－LDL－induced macrophage foam cell formation.① Polydatin inhibited ox－LDL－induced respiratory burst in macrophage;② Reactive oxygen species formation;③ Up－regulated SOD activity and protected mitochondria，inhibited activation of MAP kinases and PPARγ transactivation on the regulation of CD36 expression;④ Inhibition of macrophage uptake lipids and foam cells formation.圖5 虎杖苷抑制ox－LDL誘導泡沫細胞形成的可能靶點示意圖

這些活性氧的產生可進一步攻擊線粒體膜上的脂質，使其過氧化而破壞線粒體膜的穩定結構，造成線粒體高能電子和氧自由基的釋放。線粒體呼吸鏈由4種復合物組成，其中復合體III的Q循環中Qo位點中半醌自由基(UQH·)已明確是的單電子來源。已有報道證明，白藜蘆醇可以抑制線粒體復合物III產生的超氧陰離子[6]，因而白藜蘆醇具有抑制巨噬細胞呼吸爆發產生兩大途徑的雙重功能。我們的結果顯示，虎杖苷對抑制氧化低密度脂蛋白誘導的巨噬細胞呼吸爆發及自由基產生具有十分顯著的作用。

細胞內的抗氧化系統包括抗氧化劑和抗氧化酶兩部分。虎杖苷作為抗氧化劑本身具有一定的抗氧化能力，但是它對抗氧化酶表達和功能的調節則具有十分重要的意義。SOD是生物體內重要的抗氧化酶和清除自由基的首要物質。它催化如下反應:+2H+→H2O2+O2，因而它可以淬滅NADPH氧化酶產生的以及線粒體滲透出來的超氧陰離子為過氧化氫和氧氣，從而阻斷氧自由基對細胞的損害[7]。我們的研究發現，虎杖苷能夠增強SOD的活性，從而淬滅巨噬細胞激活產生的氧自由基，阻斷自由基作為第二信使的進一步反應。

自由基在細胞內發揮第二信使的作用，誘導細胞作出一系列的氧化應激反應，例如細胞骨架的改變，細胞因子的表達釋放和細胞膜蛋白受體的表達，包括清除氧化低密度脂蛋白的清道夫受體CD36等[8]。CD36是巨噬細胞攝取氧化低密度脂蛋白的主要受體。Febbraio等[9]用CD36基因敲除小鼠來研究其在動脈粥樣硬化形成過程中的作用。他們發現，與對照組相比，敲除CD36基因后，小鼠的腹膜巨噬細胞對ox－LDL的結合和攝取能力顯著降低。在有關人巨噬細胞的研究中也發現，CD36基因的表達對ox－LDL的結合和攝取有一定的影響。在亞洲人群中檢測到CD36基因的多態性，該基因多態性可導致CD36表達缺陷(NAKa－表型)。與正常對照組的細胞相比，這些病人體內分離出來的單核細胞源性巨噬細胞與ox－LDL和膽固醇酯的結合減少了40%，這進一步表明了CD36是 ox－LDL的生理性受體[10]。CD36/apoE雙基因敲除鼠(DKO)喂飼高脂飲食后，小鼠的主動脈斑塊面積減少了70%，文獻報道[11]CD36是致動脈粥樣硬化脂質的主要受體。我們以往的研究證明，ox－LDL誘導的CD36表達是經過MAPK激酶通路調節的。ox－LDL激活p38蛋白激酶，而p38蛋白激酶抑制劑特異而有效地阻斷ox－LDL誘導的CD36的表達。進一步的研究顯示，p38蛋白激酶是通過調節PPARγ的活性調控CD36的表達[12]。因此，氧化應激對CD36的表達有重要的調節作用。本文的結果顯示，虎杖苷有抑制ox－LDL誘導CD36表達的作用，這其間的主要機制是它的抗氧化功能起作用，其下調CD36的機制可能也包括阻滯MAPK家族成員對PPARγ(CD36調控的關鍵蛋白)的磷酸化作用。我們的后續工作會對此問題繼續進行深入的研究。

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