同型半胱氨酸促進大鼠血管平滑肌細胞增殖和表型轉化*

王生蘭，劉輝琦，曹學鋒，劉 杰， 吳 穹

(青海大學醫學院病理生理學教研室，青海 西寧 810001)

血管平滑肌細胞 (vascular smooth muscle cell，VSMCs)增殖是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)、血管成型術后再狹窄等多種心血管疾病的共同病理基礎[1]。近年來大量研究表明，高同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)血癥是造成AS的獨立的危險因素，在心、腦血管疾病及外周血管硬化等疾病發病機制中起重要作用[2]，其主要分子機制至今仍不清晰，Hcy促平滑肌細胞增殖的效應被認為是其促AS的機制之一[3，4]。但Hcy對 VSMCs表型轉化是否有影響少見文獻報道。本研究探討Hcy對VSMCs增殖和表型轉化的影響，為闡明Hcy致AS的發生機制提供依據。

材料和方法

1 材料

SD大鼠由蘭州大學動物中心提供;Ⅰ型膠原酶(collagenaseⅠ)購自 Sigma;胰蛋白酶(trypsin)、DEME/F12干粉狀培養基購自Gibco－BRL;Transzol總RNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司;RT－PCR兩步法試劑盒購自TaKaRa;四甲基偶氮唑鹽[3－(4，5－dimethylthiazol－2－yl)－2，5－diphenyltetrazolium bromide，MTT]和碘化丙啶(propidium iodide，PI)購自Sigma;小牛血清購自杭州四季青生物工程材料研究所;PCR擴增引物由Invitrogen合成。

2 大鼠VSMCs的體外培養、鑒定和分組

采用酶消化法分離培養。純種雄性SD大鼠，體重180－220 g，無菌條件下分胸腹主動脈，移入超凈臺，刀背刮去內膜，從外膜上撕下中膜，用Ⅰ型膠原酶消化分離 VSMCs。用 DMEM/F12培養液，在37℃、5%CO2培養箱(濕度100%)內靜置進行原代培養和傳代培養。在倒置顯微鏡下進行觀察，并做α－actin肌動蛋白免疫組化檢測。取3－6代細胞用于實驗，將細胞分別置于終濃度為 0、50、100、200、500和1000 μmol/L Hcy的培養液中孵育24 h。

3 細胞增殖的MTT實驗檢測

分別收集對數生長期的細胞，用胰酶消化，制成細胞懸液 (5 ×1012cells/L)，加入96孔培養板，每孔200 μL，置 5%CO2、37 ℃ 的培養箱中，培養 24 h后，吸出培養液，分別按分組設計加入Hcy液，培養24 h后，每孔加入 20 μL MTT(5 g/L)，置 5%CO2、37℃的培養箱中作用 4 h，除去上清液，加入150 μL DMSO溶解，平板振蕩儀振蕩10 min，酶聯免疫儀490 nm波長檢測各孔吸光度A值。

4 流式細胞術檢測細胞周期

細胞用0.25%胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，1000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌2次，加入磷酸鹽緩沖液PBS 0.5 mL混懸細胞。用4#注射針頭將細胞打入4℃預冷的盛有乙醇的離心管中(乙醇終濃度為70%)固定，4℃冰箱保存。染色前用PBS洗滌，去除固定液。PI染色，4℃避光30 min，上機檢測。

5 RT－PCR法檢測平滑肌22α(smooth muscle 22 alpha，SM22α)mRNA 的表達

收集各組細胞，用Transzol總RNA抽提試劑盒抽提總RNA。取各組細胞的總RNA各1 μg，按RT－PCR試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA，取產物3 μL進行PCR循環(PCR擴增條件:94℃預變性3 min，94 ℃1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，擴增30 個循環。每份樣本以L19作為內參照。引物序列:SM22α(平滑肌 22α，311bp)[5]，正義鏈 5'－ AAG CCA GTG AAG GTG CCT GAG －3'，反義鏈 5'－ TTG AAG GCC AAT CAC GTG CTT－3';L19(ribosomal protein，核糖體蛋白，內參照，194 bp)，正義鏈5'－CTG AAG GTC AAA GGG AAT GTG －3'，反義鏈5'－GGA CAG AGT CTT GAT GAT CTC－3'。反應后取終產物5 μL在1.2% 瓊脂糖凝膠中電泳分析，紫外線照像。

6 透射電鏡觀察VSMCs形態學改變

細胞用0.25%胰蛋白酶消化，在倒置顯微鏡下觀察到細胞變圓，倒去胰酶，用血清終止消化，PBS洗細胞2次，加10 mL PBS吹打制成細胞懸液，移至離心管中，用1500－2000 r/min離心15 min，棄上清，用吸管沿管壁緩慢加入0.5%戊二醛，4℃靜置30 min，用12000 r/min離心15 min，棄上清，用吸管沿管壁緩慢加入3%戊二醛固定液固定后，常規透射電鏡樣本處理及透射電鏡觀察。

7 統計學處理

結 果

1 Hcy對VSMCs增殖的影響

1.1 Hcy對VSMCs活力的影響 MTT檢測顯示，不同濃度Hcy作用24 h，隨Hcy濃度增加VSMCs細胞存活率升高，200 μmol/L、500 μmol/L、1000 μmol/L Hcy組與對照組(0 μmol/L)相比，差異顯著(P＜0.05)，見表1。

表1 Hcy對VSMCs活力的影響Table1.Effect of Hcy on VSMCs viability(24 h)(.n=3)

表1 Hcy對VSMCs活力的影響Table1.Effect of Hcy on VSMCs viability(24 h)(.n=3)

*P ＜0.05 vs control group.

Hcy(μmol/L) A value Cell viability(%)00.0867 ±0.0567 100.0050 0.1117 ±0.0548 128.84100 0.1045 ±0.0515 120.53200 0.1340 ±0.0477 154.56*500 0.1578 ±0.0375 182.01*1000 0.1484 ±0.0565 176.16*

1.2 Hcy對VSMCs細胞周期的影響 流式細胞儀檢測分析顯示，0、50、100、200、500、1000 μmol/L Hcy作用 VSMCs 24 h，G0/G1期細胞逐漸減少(75.60±8.71、75.23 ±0.41、68.20 ±3.52、68.03 ±6.75、65.27 ±7.11、37.73±3.87)，S期細胞逐漸增多(23.73 ±9.05、20.47 ±5.19、21.23 ±8.51、29.93±10.23、31.80 ±7.45、61.13 ±3.61)，見圖1。

Figure1.Cells in G0/G1stage decrease and in S stage increase with the raising of DNA synthesis affected by Hcy at different concentrations for 24 h.圖1 Hcy對VSMCs細胞周期的影響

2 Hcy對VSMCs表型轉化的影響

2.1 Hcy對VSMCs SM22α mRNA表達的影響 RT－PCR結果顯示，隨Hcy濃度增大，SM22α mRNA表達減少，Hcy 1000 μmol/L 組與對照組相比(0 μmol/L)差異顯著(P ＜0.01)，見圖2。

Figure2.Effect of Hcy on VSMCs SM22α mRNA expression in VSMCs..n=3.＊＊P＜0.01 vs control(0 μmol/L)group.圖2 Hcy對VSMCs SM22α mRNA表達的影響

2.2 Hcy對VSMCs超微結構的影響 電鏡結果顯示，對照組血管平滑肌細胞為梭形，細胞內可見豐富的肌絲，內質網、高爾基復合體等細胞器較少，主要分布于核兩端;200 μmol/L Hcy作用24 h后，細胞變圓，胞內肌絲不明顯，核周圍有大量內質網、高爾基復合體，核大，染色質疏松，見圖3。

Figure3.Transmission electron microscope revealed contractile phenotype which is plentiful myofilaments，small nucleus，compact chromatin in control group(A)(EM，×10000)and showed synthetic phenotype，which is abundant mitochondrion，rough endoplasmic reticulum and Golgi's complex，puffy chromatin，loose nucleus in VSMCs treated with Hcy at a concentration of 200 μmol/L for 24 h(B)(EM，×4000).圖3 Hcy對VSMCs超微結構的影響

討 論

近年來大量研究表明，Hcy血癥是造成AS的獨立的危險因素，在心、腦血管疾病及外周血管硬化等疾病發病機制中起重要作用[2]，關于高Hcy血癥誘發AS的機制尚未完全明了。

在AS形成過程中，動脈中膜平滑肌細胞向內皮下遷移，其表型和基因表達均發生明顯改變，參與細胞間質合成，脂質沉積，斑塊鈣化，并導致血管管壁增厚，因此平滑肌細胞在AS病變形成和發展中起重要作用[5]。Hcy與血管平滑肌細胞增殖有密切關系。Tsai等[6]用與臨床高Hcy相應的劑量作用于離體培養的平滑肌細胞，結果表明，Hcy可明顯促進DNA合成，最大程度達4.5倍，同時可促進細胞周期蛋白cyclinA及cyclinD mRNA表達，導致細胞由靜止期進入分裂期，從而促進平滑肌細胞的增殖。本研究顯示，隨Hcy濃度增高，VSMCs細胞存活率逐漸增加，同時G0/G1期細胞比例逐漸降低，而S期細胞比例明顯升高，DNA合成增加，表明 Hcy可促進VSMCs增殖。

VSMCs具有收縮型和合成型2種表型[7]，細胞表型決定了細胞的生物學特性和功能，正常VSMCs是收縮型，VSMCs表型由收縮型向合成型轉化是其增生的先決條件。平滑肌22α(smooth muscle 22 alpha，SM22α)蛋白，又稱轉凝蛋白(transgelin)，是一個22 kD的細胞骨架蛋白，其功能涉及血管平滑肌細胞的收縮調節，被認為是收縮表型的標志物之一[8]。電鏡下，典型的收縮表型和合成表型的VSMCs應具有明顯的形態、結構區別。前者核小、染色質致密，胞漿富含收縮蛋白、肌絲，而較少內質網、高爾基復合體等合成、分泌性細胞器。而后者則核大、染色質疏松，少肌絲，但卻富含合成、分泌性細胞器[9]。本實驗中，不同濃度Hcy作用下SM22α的表達下調，Hcy濃度增至1000 μmol/L時差異顯著。同時200 μmol/L Hcy作用24 h后，VSMCs細胞中線粒體、粗面內質網、高爾基復合體明顯增多，胞核大、染色質疏松，呈現合成表型的特征。因此，本研究顯示，同型半胱氨酸在促進VSMCs增殖的同時可促進其表型轉化。

絲裂素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)是引起細胞增殖反應的細胞外信號向細胞內轉導的共同通路，通過磷酸化而活化，Woo等[10]實驗發現臨床高Hcy刺激牛平滑肌細胞增殖，且用MAPK磷酸化抑制劑可抑制Hcy誘導的MAPK磷酸化及平滑肌細胞增殖，說明Hcy刺激牛平滑肌細胞增殖的過程中包含了MAPK磷酸化的激活。VSMCs的表型轉換受一系列復雜的信號分子和環境因素整合效應的影響。Karra等[11]研究顯示，可能有數百個基因的改變參與了表型轉換和AS的早期進展，涉及表型轉換相關的基因多為轉錄因子編碼基因，而涉及 AS早期進展的基因則多與脂質代謝相關。目前最受人關注的順式調控元件為CArG，CArG元件的啟動幾乎為SMCs所有分化標志基因的表達所必需。該序列是轉錄因子血清反應因子(serum response factor，SRF)的結合位點，SRF與 CArG的結合即激活一些早期基因促進細胞的生長和增殖，如 c－fos;也激活促進細胞分化的基因，如 SM－αactin、SM－MHC和肌動蛋白相關蛋白(SM22－actin，SM22 α)等。Owens等[12]發現，凝血酶和胎牛血清在引起SMCs增殖的同時并不影響 VSMCs的 SM－α－actin等分化基因的表達。Su等[13]在觀察活性氧對VSMCs分化的調節機制時發現，活性氧通過p38MAPK信號通路促進 VSMCs的分化。因此，SMCs增殖的調控與 SMCs分化、或表型轉換的調控雖然緊密相關，但并不完全呈此消彼長的關聯方式。同型半胱氨酸引起VSMCs表型轉化是否通過MAPK通路，其分子機制如何，有待進一步研究。

[1]Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis:a perspective for the 1990s[J].Nature，1993，362(29):801 －809.

[2]Anderson JL，Muhlestein JB，Horne BD，et al.Plasma homocysteine predicts mortality independently of traditional risk factors and C－reactive protein in patients with angiographically defined coronary artery disease[J].Circulation，2000，102(11):1227 －1232.

[3]Lentz SR.Mechanism of homocysteine induced atherothrombosis[J].Thromb，2005，3(8):1646 －1654.

[4]譚紅梅，趙 馳，吳偉康，等.同型半胱氨酸對血管內皮細胞增殖、貼壁和遷移的影響[J].中國病理生理雜志，2008，24(2):390 －392.

[5]Thyberg J.Caveolae and cholesterol distribution in vascular smooth muscle cells of different phenotypes[J].J Histochem Cytochem，2002，50(2):185－195.

[6]Tsai JC，Perrella MA，Yoshizumi M，et al.Promotion of vascular smooth muscle cell growth by homocysteine:a link to atherosclerosis[J].Proc Natl Acad Sci USA，1994，91(14):6369－6373.

[7]張英民，黨紅波，王克強，等.ET－1促進人血管平滑肌細胞的表型變化和增殖[J].解剖學雜志，2003，26(3):215－218.

[8]Feil S，Hofmann F，Feil R.SM22[alpha]modulates vascular smooth muscle cell phenotype during atherogenesis[J].Circ Res，2004，94(7):863 －865.

[9]Thyberg J，Hedin U，Sjolund M，et al.Regulation of differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells[J].Arteriosclerosis，1990，10(6):966 －990.

[10]Woo DK，Dudrick SJ，Sumpio BE.Homocysteine stimulates MAP kinase in bovine aortic smooth muscle cells[J].Surgery，2000，128(1):59 －66.

[11]Karra R，Vemullapalli S，Dong C，et al.Molecular evidence for arterial repair in atherosclerosis[J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(46):16789－16794.

[12]Owens GK.Molecular control of vascular smooth muscle cells differentiation and phenotypic plasticity[J].Novartis Found Symp，2007，283:174－191.

[13]Su B，Mitra S，Gregg H，et al.Redox regulation of vascular smooth muscle cell differentiation [J].Circ Res，2001，89(1):39－46.