Caveolin－1在大鼠骨髓間質干細胞分化為神經細胞中的作用*

王留東，趙二義，文全慶，關文娟，魯晶晶，彭 濤，張博愛，賈延劼

(鄭州大學第一附屬醫院神經內科，河南 鄭州 450052)

骨髓間質干細胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有多向分化潛能的干細胞，在組織工程、細胞移植、基因治療等領域有十分廣闊的應用前景[1]。雖然可以采用多種方法誘導MSCs分化為神經細胞，但其分化機制尚不清楚。隨著膜細胞化學研究的深入，很多報道發現，細胞膜上的特殊結構－脂筏(lipid raft)在干細胞生長、分化中起到重要作用[2，3]。本研究以脂筏的標記蛋白 caveolin－1為參照，結合RNA干擾技術，通過觀察caveolin－1在大鼠MSCs分化為神經細胞中的表達變化，初步探討脂筏在MSCs分化中的作用。

材料和方法

1 動物

SPF級成年Wistar大鼠，8－12周，體重200－300 g，由河南省實驗動物中心提供。常規從大鼠股骨中分離提取MSCs，連續傳10代以上的細胞置于液氮中凍存備用。

2 主要試劑

DMEM液體培養基、B27、胎牛血清購自Gibco;堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)購自 PeproTechEc;caveolin －1、神經元烯醇化酶(neurone specific enolase，NSE)、神經微絲亞單位(neurofilament subunit，NF － M)、膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)兔抗多克隆抗體購自Santa Cruz;FITC標記山羊抗兔IgG(H+L)購自上海碧云天公司;大鼠Rn－caveolin－1－siRNA、陰性對照siRNA(Cy3標記)、陽性對照Rn－MAPK1(mitogen activated protein kinase 1)control siRNA、轉染試劑 HiPerFect、RNeasy Mini試劑盒、Qiagen? OneStep RT－PCR試劑盒均為 Qiagen產品;β－巰基乙醇、噻唑藍(MTT)購自Sigma;其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。所用引物由上海生物工程公司根據設計合成，見表1。

表1 引物序列Table1.Primer sequence

3 主要方法

3.1 實驗分組 取培養第10代以上的MSCs復蘇，按照2×106cells/well的比例接種于12孔培養板，置于37℃ 、5%CO2培養箱內培養，待細胞融合率為50%－70%時進行轉染。實驗根據轉染的不同，選擇同時點的MSCs分為4組，即正常對照組(未轉染)、轉染組(轉染 Rn－caveolin－1－siRNA)、陽性對照組(轉染Rn－MAPK－1 control siRNA)和陰性對照組(轉染negative control siRNA)。

3.2 大鼠MSCs轉染 按照Qiagen公司的實驗說明操作。在每孔加入1.1 mL培養基(DMEM培養基，10%胎牛血清，雙抗)，置于37℃、5%CO2培養箱內孵育。同時，分別將300 ng siRNA(Rn－caveolin－1－siRNA、Rn－MAPK1 control siRNA、negative control siRNA)溶于100 μL DMEM 培養基，再加入6.0 μL HiPerFect轉染試劑，混勻;室溫孵育10 min后;將轉染復合物均勻滴入含MSCs孔內，使siRNA的終濃度達到20 mol/L，孵育24－72 h。正常對照組不進行轉染，其它培養條件同各轉染組。轉染后在倒置熒光顯微鏡下觀察陰性對照negative control siRNA轉染后24 h、48 h、72 h觀察 MSCs熒光表達情況，評價細胞轉染效率。

3.3 體外誘導MSCs分化為神經細胞 參照我們的方法[4]，取各組細胞進行誘導實驗。D－Hanks液清洗3次，加入預誘導液(DMEM培養基，10%胎牛血清，10 μg/L bFGF)培養24 h。預誘導后，加入誘導液(DMEM培養基，200－400μmol/L β－巰基乙醇)誘導6 h。誘導后加入維持液(DMEM培養基，200－400 μmol/L β － 巰基乙醇，10 μg/L bFGF，B27)繼續維持6 d。

3.4 免疫細胞化學染色法 將各組細胞用PBS清洗之后，迅速經4%多聚甲醛固定液4℃固定20 min，0.2%Triton X －100處理10 min，并用 10%牛血清白蛋白封閉1 h。然后分別用caveolin－1抗體(2.0 mg/L)、NSE 抗體(1.0 mg/L)、NF － M(1.0 mg/L)、GFAP(1.0 mg/L)4 ℃孵育 24 h。用 PBS 洗3遍后，用FITC標記山羊抗兔IgG(1∶500)在室溫下進行染色標記、觀察。細胞圖像通過顯微鏡用10×或20×攝取，圖像均采用300 dpi分辨率。每組獨立的實驗都會采集超過20個區域的細胞。而且，在明視野下所采集的每幅圖像都盡量包含相同的細胞數目。采用雙人雙盲隨機記數陽性細胞，計算陽性細胞百分比例。

3.5 RT－PCR法 采用RNeasy Mini試劑盒分離純化各組細胞的總RNA，分光光度法測定計算提取的總RNA含量及濃度。參照Qiagen? OneStep RT－PCR試劑盒實驗操作說明進行RT－PCR，總反應體積50 μL，其中5×Qiagen OneStep RT－PCR buffer 10.0 μL，dNTP mix 2.0 μL，Qiagen OneStep RT － PCR enzyme mix 2.0 μL，5 × Q － solution 10.0 μL，RNase inhibitor 10 U，RNA1.0 μg，引物 0.6μmol/L。擴增條件為:50℃ 30 min，95℃ 15 min，94℃1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，30－35個循環，72℃10 min。然后，取RT－PCR 產物10.0 μL，加上樣緩沖液2.0 μL，在2%瓊脂糖凝膠上電泳，70 V 40 min，凝膠圖像成像系統拍攝保存實驗結果，凝膠圖像分析系統(GelPro Analyzer Version 3.0)分析各目的基因與β－actin基因條帶吸光度值。

3.6 細胞存活率檢測(MTT法) 采取四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法，按照轉染前、后各個相同時點，將各組的MSCs轉至96孔板，加MTT(5.0 g/L)50 μL/well、置于37 ℃、5%CO2培養箱內孵育4 h，離心棄上清，再加入二甲基亞砜200 μL，振蕩10 min，使結晶物充分溶解，選擇490 nm波長，采用酶聯免疫檢測儀測定各孔吸光度值，評價各組細胞存活率。

4 統計學處理

所有的圖形由ImagePro Plus 6.0軟件采集和處理。數據用均數±標準差()表示，采用Graph-Pad Prism 5.01作圖，并根據不同要求進行方差分析和χ2檢驗。

結 果

1 大鼠MSCs轉染

本研究發現，轉染后各組細胞形態變化不顯著，僅見少數細胞脫落、胞體收縮呈球形或梭形。采用Cy3標記的陰性對照(negative control)siRNA評估，大鼠 MSCs 24 h、48 h、72 h 的轉染率分別為(50.5 ±5.2)%、(70.5 ±6.5)% 和(81.5 ± 2.8)%，見圖 1。進一步采用RT－PCR驗證，正常對照組MSCs可以表達caveolin－1mRNA、MAPK1 mRNA，轉染組 MSCs表達caveolin－1mRNA顯著降低(P＜0.01)，陽性對照組MAPK1 mRNA表達也顯著減弱(P＜0.01)，而陰性對照組和未轉染組間差異無顯著，見表2。此外，轉染前、后各組MSCs的MTT結果無顯著差異(P＞0.05)，見表3。

2 體外誘導MSCs分化為神經細胞

Figure1.Cy3 labeled negative control group:72 h after negative control siRNA transfection(×200).A:inverted microscope;B:fluorescence microscope.圖1 Cy3標記的陰性對照siRNA轉染72 h

表2 RT－PCR結果Table2.The effect of RT－PCR(%..n=12)

表2 RT－PCR結果Table2.The effect of RT－PCR(%..n=12)

＊＊P ＜0.01 vs other groups.

Group Caveolin－1mRNA MAPK1 mRNA Non － transfection 0.677 ±0.023 0.908 ±0.025 Transfection 0.218 ±0.028＊＊ 0.865 ±0.035 Positive control 0.702 ±0.048 0.306 ±0.042＊＊Negative control 0.698 ±0.040 0.868 ±0.015

表3 各組的MSCs的MTT值Table3.The MTT value of MSCs in groups(%..n=12)

表3 各組的MSCs的MTT值Table3.The MTT value of MSCs in groups(%..n=12)

Group Before induction 24 h after induction 72h after induction Non－transfection 0.750 ±0.036 0.745 ±0.020 0.740 ±0.026 Transfection 0.747 ±0.048 0.720 ±0.032 0.715 ±0.028 Positive control 0.738 ±0.023 0.712 ±0.022 0.728 ±0.032 Negative control 0.736 ±0.024 0.710 ±0.031 0.726 ±0.022

正常對照組誘導6 d，多數細胞出現神經細胞改變，胞體呈多角形或圓形，周圍有光暈，突起細長，有數個分支，部分細胞在局部形成神經網絡。轉染Rncaveolin－1－siRNA組誘導后細胞形態變化更加顯著，誘導24 h，部分細胞向具有神經細胞特點的細胞轉化，細胞體逐漸變成圓形或錐形，折光性增強，胞體周圍有較強的光暈，胞體伸展的突起繼續延長，局部區域相互交織成網，誘導6 d，形成具有典型的神經細胞樣形態和神經網絡結構，見圖2。陽性和陰性對照組形態學變化與正常對照組類似。

Figure2.MSCs of Rn－caveolin－1－siRNA group were induced into neurons(6 h after induction，×200).圖2 Rn－caveolin－1－siRNA組誘導6 d向神經細胞分化

本研究選擇NSE、NF－M和GFAP蛋白鑒定分化后細胞，發現誘導前MSCs不表達上述蛋白。誘導6 d，各組均程度不等表達NSE和NF－M。其中，轉(77.84±3.58)%，顯著的高于其它各組P＜0.05，見圖3。但是各組GFAP表達率均小于5%，無顯著差異，見表4。

3 Caveolin－1的表達變化

誘導前，正常對照組大鼠MSCs的細胞膜上可以表達caveolin－1。誘導6 h，caveolin－1開始表達增強，與誘導前相比差異顯著(P＜0.05);而且隨時間延長表達持續增加，峰值在誘導6 d，與誘導前、誘導6 h相比差異顯著(P＜0.01)。陽性對照組和陰性對照組也有類似的結果，見表5。

Figure3.MSCs of Rn－caveolin－1－siRNA group were induced into neurons(6 h after induction，×200).The result observed under inverted microscope(A)and expression of NF－M observed under fluorescence microscope(B).圖3 Rn－caveolin－1－siRNA組誘導6 d向神經細胞分化及NF－M表達

表4 誘導6 d各組細胞免疫化學染色結果Table4.The immunocytochemistry stain effect(6d after induction)(%..n=6×103cells)

表4 誘導6 d各組細胞免疫化學染色結果Table4.The immunocytochemistry stain effect(6d after induction)(%..n=6×103cells)

＊＊P ＜0.01 vs other groups.

Group NSE NF－M GFAP Non － transfection 62.90 ±3.71 63.77 ±3.80 2.4±0.900 ±0.85 Transfection 81.49 ±3.07＊＊ 77.84 ±3.58＊＊ 2.60 ±0.84 Positive control 64.18 ±3.92 59.21 ±3.93 2.82 ±0.91 Negative control 63.84 ±2.71 59.56 ±4.04 3.07

Rn－caveolin－1－siRNA轉染后，MSCs細胞膜上的 caveolin－1表達顯著降低，僅為(28.53±5.00)%。誘導6 h，caveolin－1的表達也有增強的趨勢，但是與誘導前相比無顯著差異(P＞0.05);同樣誘導6 d時，caveolin－1的表達顯著增加，達到(33.84±5.91)%，與誘導前、誘導6 h相比顯著差異，P＜0.05，見圖4。此外，Rn－caveolin－1－siRNA轉染后與其它各組同時點的caveolin－1表達均顯著降低(P＜0.01)。

表5 各組細胞caveolin－1免疫化學染色結果Table5.The immunocytochemistry staining of caveolin－1(%..n=6×103cells)

表5 各組細胞caveolin－1免疫化學染色結果Table5.The immunocytochemistry staining of caveolin－1(%..n=6×103cells)

#P ＜0.05 vs 6 d after induction;＊＊P ＜0.01 vs other groups.

Group Before induction 6 d after induction Non －transfection 69.27 ±6.09# 74.11 ±4.59#6 h after induction 78.55 ±3.04 Transfection 28.53 ±5.00#＊＊ 30.21 ±2.50#＊＊ 33.84 ±5.91＊＊Positive control 68.68 ±5.24# 73.60 ±3.65# 78.51 ±3.15 Negative control 69.05 ±4.33# 74.09 ±4.50#79.46 ±3.21

Figure4.MSCs of Rn－caveolin－1－siRNA group were induced into neurons(6 h after induction，×400).The result observed under inverted microscope(A)and expression of caveolin－1 observed under fluorescence microscope(B).圖4 Rn－caveolin－1－siRNA組誘導6 d向神經細胞分化及caveolin－1表達

討 論

體外誘導MSCs分化為神經細胞是一個復雜的多信號、多通路的過程，其機制尚不清楚[5－7]。雖然很多誘導劑(如β－巰基乙醇、神經營養因子、中藥等)可以通過不同的途徑激活不同的信號通路，但是幾乎所有的誘導劑作用起點都是細胞膜。因此，探索MSCs體外誘導過程中細胞膜結構的變化，有助于對其分化機制的理解。

目前認為，細胞膜表面存在一種特殊的結構－脂筏，參與轉運、內吞、內化、鈣的動態平衡和信號轉導等一系列細胞過程[2，8]。在脂筏中，有一種特殊類型的脂筏－小凹(caveolae)，主要存在于上皮和內皮細胞膜上的許多小的瓶狀內陷結構，其胞質面由一層膜外衣覆蓋，這層外衣的主要成分是小凹蛋白(caveolin)家族，分子量為21－25 kD，屬整合蛋白，其中caveolin－1是分離膜上特化區域的標記蛋白，也是脂筏的重要標記蛋白之一[9]。本研究結果提示，大鼠MSCs可以表達 caveolin －1，與 Park 的結果類似[10]。

越來越多的研究發現，caveolin－1在干細胞信號轉導中發揮樞紐作用，多條信號轉導途徑的信號分子均集中于此。如caveolin－1可以與galectin－1、表皮生長因子等相互作用，通過 Src、Eras、Akt和mTOR等信號通路，影響胚胎干細胞的增殖和遷移[11，12]。如果基因敲除了 caveolin －1，可以促進小鼠的神經干細胞增殖[13]。本研究發現，caveolin－1在體外誘導MSCs分化為神經細胞的過程中起到兩方面作用:(1)作為一個通用的負性調節因子，抑制許多信號通路的基礎活性，如Notch通路、胰島素樣生長因子1受體通路[14，15]。Notch通路是一個多步驟、多因素參與的信號轉導過程[4]，caveolin－1可以整合 β1－integrin、Notch－1、酪氨酸激酶受體通路的相互作用。β1－integrin能通過 caveolin－1影響Notch的胞內結構域(NICD)的轉運，進而影響Notch－1信號通路;而且，在這種協同作用下，兩者調控表皮生長因子受體通路(另一條重要的神經細胞分化通路)，實現對神經細胞分化的精細調節[15，16]。本研究采用RNA干擾技術，下調caveolin－1的表達，神經細胞標記蛋白NSE、NF－M的表達顯著增加，促進了MSCs向神經細胞分化，可能與此有關。(2)caveolin－1并不單純是一個信號分子的抑制劑，其對某些信號過程中也可起促進作用[17]。如本研究發現，無論是否轉染Rn－caveolin－1－siRNA，隨誘導時間的延長caveolin－1的表達持續增加，當誘導6 d時達到峰值，與誘導前、誘導6 h相比，均有顯著差異，揭示了caveolin－1表達變化在此過程中的復雜性。

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