樺樹桑黃液體發酵培養基優化研究*

張文雋，吳亞召，雷 萍，孫悅迎

（陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043）

桑黃Phellinus igniarius(L.ex Fr.)Quel.，屬擔子菌亞門，是火木層孔菌 （P.igniarius）、鮑氏針層孔菌 （P.baumii）和裂蹄針層孔菌 （P.linteus）的俗稱，生長于楊、桑、柳、白樺、櫸和桃等闊葉樹的枯立木、立木及樹干上[1]。

自1968年，日本學者Ikekaw等發現，桑黃野生子實體的提取物對小鼠肉瘤S180的抑制率為96.7%[2]。目前對桑黃的藥用功能進行了廣泛研究，發現桑黃具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌等藥理作用[3]，是國際公認生物治癌領域有效率排在第一的藥用真菌，已成為該研究領域的一個熱點。桑黃活性成分多糖是從子實體中提取，受生理生態特殊性及環境條件制約，自然形成的子實體稀少，人工栽培難度較大。所以，桑黃的開發和利用也受到限制。為了解決這個難題，本試驗對其液體發酵工藝進行了研究，初步篩選出適宜菌絲體生長的液體培養基配方，為進一步開發桑黃菌產品提供了技術依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

樺樹桑黃菌種來自于陜西省微生物研究所微生物資源中心3室。

1.2 培養基

1.2.1 母種培養基

采用PDA綜合培養基。

1.2.2 碳源測定基礎培養基

蛋白胨0.5%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、VB110 mg·100－1·mL－1， pH 自然。

1.2.3 氮源測定基礎培養基

葡萄糖2%、 KH2PO40.1%、 VB11 mg·100－1·mL－1、MgSO40.05%、，pH自然。

1.2.4 試驗培養基

將碳源基礎培養基中的葡萄糖分別以蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米粉取代，進行碳源試驗；將氮源測定基礎培養基中的蛋白胨分別以酵母膏、 (NH4)2SO4、麥麩、黃豆粉、尿素代替進行氮源試驗。

1.2.5 優化培養基

試驗以玉米粉 （A）、葡萄糖 （B）為復合碳源，以麥麩 （C）、蛋白胨和酵母膏 （D）為復合氮源，采取四因素三水平正交試驗的方法，對樺樹桑黃菌絲體液體培養基進行優化。

1.2 護理質量管理 質量管理是指確定質量方針、目標和職責，并在質量體系中通過諸如質量策劃、質量控制、質量保證和質量改進，使其實施全部管理職能的所有活動。護理質量管理是指按照護理質量形成的過程和規律，對構成護理質量的各要素進行計劃、組織、協調和控制，以保證護理服務達到規定的標準和滿足服務對象需要的活動過程。

1.3 方法

1.3.1 固體培養方法

按PDA綜合培養基配方配制，高壓滅菌后制斜面，無菌條件下接種樺樹桑黃菌菌種塊0.3 cm2，在28℃條件下恒溫培養至斜面長滿，得一級菌種備用。

1.3.2 碳源篩選試驗

取一級樺樹桑黃菌菌種0.5 cm2，分別接種于6種不同碳源培養基中，于28℃條件下靜置培養16 d，每次試驗重復5次，結果取平均值。

1.3.3 氮源篩選試驗

取一級樺樹桑黃菌菌種0.5 cm2，分別接種于7種不同氮源培養基中，于28℃條件下靜置培養16 d，每次試驗重復5次，結果取平均值。

1.3.4 菌絲生長量的測定

發酵液用紗布過濾后，菌絲體用清水沖洗干凈，置70℃烘箱烘干至恒重，稱量。

1.3.5 正交試驗篩選最佳培養基配方

取一級樺樹桑黃菌菌種0.5 cm2，分別接種于9種不同的正交試驗培養基中，于29℃條件下靜置培養16 d，每次試驗重復5次，結果取平均值。試驗因素及其各水平見表1。

表1 L9(34)正交試驗的因素及水平設計

2 結果與分析

2.1 培養基成分對菌絲產量的影響

2.1.1 碳源的篩選試驗

在碳源基礎培養基中分別加入各種碳源2%，進行碳源的篩選試驗，試驗重復5次，取菌絲干重平均值。結果見表2。

表2 不同碳源對樺樹桑黃發酵菌絲生長量的影響

從表2可以看出，樺樹桑黃以玉米粉作為碳源效果最好，其次是葡萄糖、蔗糖等。

2.1.2 氮源篩選試驗

在氮源基礎培養基中分別加入各種氮源0.5%，進行氮源的篩選試驗，試驗重復5次，取菌絲干重平均值。結果見表3。

從表3可以看出，樺樹桑黃最適發酵用氮源為麥麩，其次是黃豆粉、蛋白胨、 (NH4)2SO4等。

表3 不同氮源對樺樹桑黃發酵菌絲生長量的影響

2.1.3 正交試驗結果與直觀分析

L9(34)正交試驗結果直觀分析結果見表4。

表4 L9(34)正交試驗結果直觀分析表

從表4可以看出9個處理中，處理2的菌絲干重最大14.85 g·L-1，由此得出較優的樺樹桑黃發酵培養基配方為玉米粉1%、麥麩1%、葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、酵母膏0.5%、 磷酸二氫鉀 0.1%、 維生素 B11 mg·100-1·mL-1、 硫酸鎂0.05%。處理6次之，處理3、處理4較差。

3 討論

通過該篩選試驗發現，樺樹桑黃菌絲體最適碳源是玉米粉，最適發酵用氮源為麥麩。葡萄糖也可作為發酵碳源，但玉米粉價格低廉，本試驗選擇玉米粉做發酵碳源。

采用正交方法優化出了樺樹桑黃菌絲體發酵培養的培養基配方。結果表明，玉米粉1%、麥麩1%、葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、酵母膏0.5%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.05%、 維生素 B11 mg·100-1·mL-1。

[1]卯曉嵐.中國大型真菌[M].河南：河南科技出版社，2000.

[2]Shihata S,Nishiawa Y,Mai CF,et al.Anti-tumor stuies on some extracts of Basidiomycetes[J].Gann,1968(59):159-161.

[3]張萬國.桑黃抗肝纖維化及其作用機理的研究[D].上海：第二軍醫大學，2002.