流行性乙型腦炎病毒E蛋白單克隆抗體的制備與鑒定

趙付榮,華榮虹,王 斌,陳娜莎,阿合買提·買買提,步志高

(1.新疆農業大學動物醫學院,新疆 烏魯木齊 830052;2.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所農業部獸醫公共衛生重點開放實驗室獸醫生物技術國家重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150001)

流行性乙型腦炎(JE)簡稱乙腦,是由乙型腦炎病毒引起的一種重要蚊媒性人獸共患傳染病。多種動物易感,蚊是JEV的主要傳播媒介,豬是其主要的儲存宿主和擴散宿主。乙腦對豬的危害主要為:妊娠母豬發生流產和死胎,公豬發生睪丸炎,育肥豬持續高熱,新生仔豬腦炎。該病主要流行于東亞和南亞各國,而我國是乙腦發病人數最多的國家,占世界總發病數的80%以上[1]。近年來,乙腦的流行分布范圍呈擴大的趨勢,乙腦的診斷和防治研究具有重要的公共衛生學意義。

JEV屬于黃病毒科黃病毒屬,基因組為正鏈單股RNA病毒,基因組長度11 kb。病毒粒子有3個結構蛋白:核衣殼蛋白(C)、膜蛋白(PrM/M)、囊膜糖蛋白(E)。E蛋白基因大小為1500 bp,由其編碼的E蛋白是病毒粒子表面最重要的結構蛋白,其表面的抗原決定簇,具有血凝活性和中和活性。E蛋白與病毒的毒力、宿主范圍、組織嗜性、膜融合、保護性免疫、血凝反應和血清特異性有關[2-4]。本研究成功制備1株抗JEV E蛋白的單克隆抗體,并對其部分性質進行了鑒定,為今后探索新的JE臨床診斷方法及E蛋白結構與功能提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 質粒、菌種、實驗動物及試劑 含E基因的原核表達質粒 pET32a-E,大腸桿菌 BL21(DE3)、BHK-21細胞、SP2/0細胞,表位融合蛋白GST-E1、GST-E10、GST-E11、GST-E19、GST-E33、GSTE39、GST-E45、GST-E48、GST-E49 及 GST 純化蛋白均由獸醫生物技術國家重點實驗室制備或保存。實驗用SPF級BALB/c小鼠購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心。

1.2 重組JEV E蛋白的表達與純化 將表達菌種接種于含100 mg/L氨芐青霉素的 LB培養基中,37℃培養過夜后,按1∶100接種于新鮮LB培養基中,繼續培養至對數生長期,加IPTG誘導,培養物離心后用1/20體積 PBS重懸,超聲波裂解后12000 r/min離心,分離上清和沉淀,12%SDSPAGE檢測表達情況。表達蛋白包涵體按文獻[7]方法進行分離純化。

1.3 小鼠免疫 以純化的 JEV E蛋白對8周齡SPF級BALB/c小鼠按如下程序免疫:首次免疫用純化的E蛋白和弗氏完全佐劑等量混合,充分乳化,于小鼠頸背部分多點皮下注射;間隔2周用弗氏不完全佐劑乳化抗原加強免疫2次,取脾細胞融合前3天用純化抗原經尾靜脈加強免疫1次。

1.4 細胞融合、雜交瘤細胞的篩選及純化 細胞融合過程按文獻報道的方法[6]進行。以純化的E蛋白作為包被抗原,用間接ELISA方法篩選陽性細胞克隆株。將經初步篩選得到的可疑陽性細胞克隆株用有限稀釋法再進行3～5次單克隆,同時用間接ELISA方法進行檢測,直至所有克隆化細胞孔檢測陽性率為100%時,即可確定已獲得穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。單克隆經擴大培養凍存于液氮中。

1.5 單克隆抗體腹水的制備 取成年的BALB/c小鼠,于腹腔內預先注入0.5mL的弗氏不完全佐劑,1周后,再將篩選到的陽性雜交瘤細胞分別以3×105個/0.5mL細胞的劑量注入小鼠的腹腔,約7 d左右,當小鼠的腹腔增大時,抽取腹水,5000 r/min離心取上清,-20℃凍存備用。

1.6 單抗效價的測定及亞類鑒定 切膠純化E蛋白為抗原,用間接ELISA法測定培養雜交瘤細胞上清和小鼠腹水單克隆抗體效價。亞類的鑒定試劑盒說明書方法操作。

1.7 Western blot鑒定 參考文獻[7]進行。以單克隆雜交瘤細胞培養上清作為一抗,以SP2/0細胞上清做陰性對照,以紅外熒光標記的羊抗鼠IgG抗體作為二抗,用紅外熒光掃描儀進行掃描。

1.8 單克隆抗體的特異性鑒定 分別以純化的表位融合蛋白 GST-E1、GST-E10、GST-E11、GSTE19、GST-E33、GST-E39、GST-E45、GST-E48、GST-E49與GST為抗原分別包被ELISA板,用間接ELISA方法檢測雜交瘤細胞培養上清液與表位融合蛋白的反應性,以純化的GST蛋白作為陰性對照。

2 結果

2.1 重組蛋白的表達與純化 重組質粒經測序檢驗正確后,轉化至感受態細胞BL21(DE3),經IPTG誘導表達和分離純化后進行SDS-PAGE分析,可見大小約70 ku的目的蛋白的表達,與預期結果一致(圖1),且純化后的蛋白可被豬陽性血清識別(圖1)。

圖1 E蛋白表達的表達與純化

2.2 雜交瘤細胞株的建立 經過融合、間接ELISA檢測和4次亞克隆,共篩選到1株穩定分泌抗JEV E蛋白的雜交瘤細胞,將其命名為5D4。該雜交瘤細胞經液氮凍存復蘇后,生長狀態良好,分泌抗體能力正常。

2.3 McAb效價以及Ig亞類鑒定 雜交瘤細胞培養上清液做2倍系列稀釋,腹水先100倍稀釋,再做2倍系列稀釋,以純化E蛋白為包被抗原進行間接ELISA檢測。結果表明,細胞培養上清液的抗體效價為1∶1024,腹水抗體效價為1∶409600。經鑒定,該單抗亞型為IgG2a,輕鏈為κ鏈。

2.4 單抗的免疫活性分析 將JEV SA14-14-2株接種BHK-21細胞作為抗原,進行SDS-PAGE。通過半干電轉儀轉印至NC膜,以單克隆雜交瘤細胞培養上清作為一抗,以SP2/0細胞上清做陰性對照,以FITC標記的羊抗鼠紅外熒光作為二抗,然后在紅外熒光掃描儀進行掃描。結果可見15株單抗均能特異性地識別表達的重組蛋白及JEV SA14-14-2株感染細胞中的E蛋白,在53 ku處有一明顯特異反應條帶,而陰性對照 SP2/0培養上清不與JEV E蛋白發生反應(圖2)。

圖2 Western blot檢測單克隆抗體免疫活性

2.5 單克隆抗體的特異性試驗 分別以純化的融合蛋 白 GST-E1、GST-E10、GST-E11、GST-E19、GST-E33 、GST-E39 、GST-E45 、GST-E48 、GST-E49和純化的GST蛋白為包被抗原,采用間接ELISA檢測雜交瘤細胞培養上清。結果顯示,單抗5D4能與GST-E10反應,而與GST不反應。表明該單抗是針對表位E10的。

3 討論

對乙型腦炎尚無特效治療方法,早期診斷仍是有效控制該病的重要手段,各種針對病毒結構蛋白的免疫學診斷技術以其特異性強、成本較低、易操作等特點成為實踐中檢測病原的常用方法。免疫學診斷的特異性和準確性直接取決于診斷試劑,目前應用于診斷的抗體制劑多是由全病毒抗原免疫動物制備的多克隆抗血清,其復雜的抗體成分和由不同動物個體和不同批次制備免疫血清造成的抗體效價的差異,使檢測的穩定性、特異性受到限制。單克隆抗體純度高、專一性強、重復性好且能在動物體外或體內產生同質性抗體,以它作為診斷抗體能克服多克隆抗血清診斷時穩定性差及非特異性強等缺點。

本試驗在制備JEV E蛋白單抗的過程中,將純化的E蛋白免疫BALB/c小鼠,提高了抗 E蛋白McAb的陽性率,用淋巴細胞雜交瘤技術建立了1株分泌抗E單克隆抗體的雜交瘤細胞系,篩選時用純化的E抗原包被反應板采用間接ELISA方法進行檢測,這種高純度的包被抗原使得篩選方法簡便、高效。獲得的1株能穩定分泌抗E的單克隆的雜交瘤細胞株,Western blot結果也表明此株抗JEVE蛋白McAb特異性強,表位鑒定表明此株單克隆抗體是針對表位E10的,有研究表明表位E10處于E蛋白的免疫優勢決定區[8]。從一定意義上說,表位疫苗是縮微的亞單位疫苗。基于多表位的疫苗含有廣譜的表位信息,可以避免因病毒變異而造成的疫苗免疫失敗。但在各分離株中高度保守的表位序列(特別是中和表位),在疫苗的研制中具有重要的參考價值。所以本研究結果為下一步探索新的JE診斷方式奠定了基礎,同時也為研究E蛋白的免疫保護機制提供了物質條件。

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