錳致雞睪丸DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)的研究

張黎明,張麗娜,李志鵬,徐世文

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030)

1931年,Kemmem等首先發(fā)現(xiàn)錳為大鼠、小鼠維持正常生長和生殖性能所必需。錳作為動物體內(nèi)一種必需微量元素,參與機(jī)體糖代謝、脂肪代謝、凝血機(jī)制、生長發(fā)育、神經(jīng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)等活動,同時錳也是一種常見的職業(yè)和環(huán)境污染物[1-3]。目前人們對錳毒性的研究多注重在神經(jīng)系統(tǒng)方面,近幾年來,隨著生殖毒理,生殖流行病學(xué)和生殖生化領(lǐng)域研究的發(fā)展,錳對生殖系統(tǒng)的損害已漸漸受到了人們的重視[4]。但是錳的生殖毒性研究主要集中在人和鼠上,未見有關(guān)禽類的相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)通過在飼料中添加不同劑量的氯化錳,復(fù)制亞慢性錳中毒模型,通過檢測雞睪丸組織DPC含量的變化,探討錳致雞睪丸細(xì)胞DNA的損傷作用,為研究錳的毒性機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組與處理 健康50日齡海藍(lán)褐公雞240只隨機(jī)分成4組,每組60只,對照組飼喂基礎(chǔ)日糧,低劑量組飼喂基礎(chǔ)日糧+500 mg/kg MnCl2,中劑量組飼喂基礎(chǔ)日糧+800 mg/kg MnCl2,高劑量組飼喂基礎(chǔ)日糧+1700 mg/kg MnCl2,分籠常規(guī)飼養(yǎng)。分別與染錳后 30、60 d和 90 d時,每組隨機(jī)抽取5只剖殺,取睪丸組織檢測相應(yīng)指標(biāo)。

1.2 主要試劑和儀器 氯化錳(天津博迪化工),十二烷基硫酸鈉(SDS),蛋白酶K(Merk公司),Hoechst33258熒光染料(Sigma公司),小牛胸腺DNA(Sigma公司),其余化學(xué)試劑皆為國產(chǎn)分析純。7230G可見光分光光度計(jì)(上海分析儀器總廠),970CRT熒光分光光度計(jì)(上海棱光精密科學(xué)儀器有限公司),F0630低溫高速離心機(jī)(德國BAKEMAN公司)。

1.3 DPC含量的檢測 采用KCl-SDS沉淀法進(jìn)行檢測[5-7]。先制作DNA濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線:用清洗緩沖液配制終濃度分別為0、100、300、500、750、1000、1500、2000、3000、5000 ng/mL 的小牛胸腺 DNA標(biāo)準(zhǔn)液,即加入1mL新鮮配制的400 ng/mL的熒光染料Hoechst33258,使其終濃度為200 ng/mL,置于暗處30 min,然后用970CRT熒光分光光度計(jì)儀在350 nm激發(fā)光和450 nm發(fā)射光下測得各濃度的熒光值,制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1),回歸方程為:y=0.7202x+4.9392,r2=0.9996。將染色后的樣品用970CRT熒光分光光度計(jì)測定其熒光值,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量交聯(lián)DNA和自由DNA,再計(jì)算DPC系數(shù)η。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 睪丸組織中DPC含量的檢測結(jié)果 由表1可知,在不同時間點(diǎn)隨著染毒劑量的加大,染毒組DPC含量呈上升趨勢;在各時間點(diǎn),各染毒組與對照組比較除30 d、60 d低劑量組與對照組差異不顯著外(P＞0.05),其他各染毒組與對照組間均差異顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01),各染毒組間除60 d、90 d中劑量組與高劑量組差異不顯著外(P＞0.05),其他各組差異均顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)。

2.2 生精細(xì)胞凋亡指數(shù)的檢測結(jié)果 由表2可知,在錳中毒90 d時,生精細(xì)胞凋亡的數(shù)量均由對照組到高錳組逐漸增加,各劑量組間差異均極顯著(P＜0.01)。

表1 睪丸組織中DPC含量的測定

表2 生精細(xì)胞的凋亡指數(shù)

3 討論

DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)(DPC)環(huán)境理化因素對生物大分子物質(zhì)的一種重要遺傳損害,已有研究發(fā)現(xiàn)許多環(huán)境污染物和化學(xué)致癌物包括甲醛、烷化劑、砷化合物以及一些重金屬如鎘、鎳等均可引起DPC[8]。與其他類型的DNA損傷相比,DPC較難修復(fù),易造成一些重要的基因丟失[9]。正常細(xì)胞中存在著一定數(shù)量的 DPC,但 DPC過量增加則是一種病理現(xiàn)象[10]。

錳是一種常見的環(huán)境和職業(yè)污染物,具有生殖遺傳毒性[11]。王子元等[12]通過給小鼠腹腔注射氯化錳染毒,研究錳對雄性生殖細(xì)胞的遺傳毒性,結(jié)果顯示,無論顯性致死試驗(yàn)中的平均死胎數(shù)和突變指數(shù)還是睪丸染色體畸形分析,染毒組與對照組比較都有顯著差異,說明錳對雄性生殖細(xì)胞有遺傳毒性。本試驗(yàn)中隨著染毒劑量的加大及染毒時間的延長,在不同的時間點(diǎn)各染毒組與對照組相比都可以顯著誘導(dǎo)DPC效應(yīng)和生精細(xì)胞細(xì)胞凋亡的發(fā)生,并且存在明顯的時間劑量效應(yīng),另外通過剖檢變化、組織切片的光鏡和電鏡觀察睪丸組織,發(fā)現(xiàn)染錳組雞只睪丸體積與對照組相比出現(xiàn)不同程度的縮小,光鏡觀察可見曲細(xì)精管內(nèi)精原細(xì)胞排列紊亂、支持細(xì)胞,有的曲細(xì)精管萎縮、變形,生精上皮變薄,各級生精細(xì)胞減少或缺如,部分脫落至管腔,部分管腔可見壞死細(xì)胞碎片,染錳組雞只睪丸超微結(jié)構(gòu)發(fā)生形態(tài)改變,部分生精細(xì)胞核皺縮,染色質(zhì)濃集、邊聚,核膜間隙大,核仁凝聚成團(tuán),間質(zhì)細(xì)胞核濃縮,核與核膜分離,線粒體腫脹,嵴模糊,形成空泡、部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹,說明錳中毒可造成顯著的DPC效應(yīng),阻礙DNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄,造成DNA復(fù)制過程中某些基因的丟失,嚴(yán)重?fù)p傷DNA,進(jìn)而可引發(fā)生精細(xì)胞凋亡,由此對睪丸組織發(fā)育和精子生成產(chǎn)生損害。然而DPC是否可以作為錳暴露和遺傳毒性的生物標(biāo)志物還需進(jìn)一步的研究證明。

[1]李興升,李季蓉,張先平,等.氯化錳對小鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)的影響[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2006,29(3):216-218.

[2]Crittenden P L,Filipov N M.Manganese-induced potentiation of in vitro proinflammatory cy tokine production by activated microglial cells is associated with persistent activation of p38 M APK[J].Toxicology in Vitro,2008,22:18-27.

[3]M ontes S,Sabido-Pedraza E,Rí os C,et al.Biomarkers of manganese exposure in a population living close to a mine and mineral processing plant in Mexico[J].Environmental Research,2008,106:89-95.

[4]才秀蓮,李興升,李季蓉,等.染錳鼠睪丸增殖細(xì)胞核抗原與熱休克蛋白表達(dá)[J].中國公共衛(wèi)生,2005,21(11):1331-1333.

[5]Subhendra N Mattagasingh,Hara P Misra.Analy sis of EDTA-chelatable protein from DNA-protein crosslinks induced by a carcinogenic chromium(Ⅵ)in cultured intact human cells[J].M olecular and cellular biochemistry,1999,199:149-162.

[6]劉丹丹,王博.氣態(tài)甲醛致雌性小鼠生殖細(xì)胞DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)的研究[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào),2006,1(3):250-253.

[7]王黎明,丁書茂,吳凱,等.鄰苯二甲酸二乙基乙酯致小鼠不同器官細(xì)胞DNA-蛋白質(zhì)效應(yīng)研究[J].公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué),2006,17(4):5-8.

[8]Barker S,Weinfeld M,Murray D.DNA-protein crosslinks:their induction,repair,and biological consequences[J].Mutation Reseach,2005,589:111-135.

[9]Barker S,Murray D,Jing Zheng,et al.A method for the isolation of covalent DNA-protein crosslinks suitable for proteomics analy sis[J].Analysis Biochemistry,2005,344:204-215.

[10]Oliver M erk,K ristin Reiser,Gunter Speit,et al.Analy sis of chromate-induced DNA-protein crosslinks with the comet assay[J].Mutation Research,2000,471:71-80.

[11]樊衛(wèi)萍,袁淑芳,吉順福.錳的遺傳毒性及鋅對其毒性的拮抗作用[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué),2007,24(5):516-518.

[12]王子元,李玉貴,林磊光,等.氯化錳對雄性小鼠生殖細(xì)胞誘變性的研究[J].中國工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志,2002,15(1):8-12.