HPLC法測定豆腐渣果中豆腐果苷的含量

楊勝，蘇柘僮，楊明

豆腐渣果為山龍眼科山龍眼屬（Helicia）植物深綠山龍眼（Helicia nilagirica Bedd）的種子，其有效成分豆腐果苷（Helicid，對苯甲醛-O-β-D-阿洛吡喃糖苷）的化學(xué)結(jié)構(gòu)類似于天麻苷（Gastrodin，對羥甲基苯-O-β-D-吡喃葡萄糖苷）[1]。藥理研究表明，豆腐果苷對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用與天麻苷相似，但其鎮(zhèn)靜止痛作用較天麻苷強(qiáng)，對神經(jīng)官能癥引起的頭痛、頭昏、睡眠障礙的治療作用顯效快[2]。因此，豆腐渣果在神經(jīng)官能癥治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。目前已有以豆腐果苷為主要原料的市售品種豆腐果苷片，用于緩解神經(jīng)官能癥引起的頭痛、頭昏及睡眠障礙，輔助治療原發(fā)性頭痛[3]。雖然目前關(guān)于豆腐渣果化學(xué)成分、藥理作用方面的研究報(bào)道較多，但是關(guān)于豆腐渣果含量測定方法的研究報(bào)道卻較少。鑒于此，本文擬建立 HPLC 測定豆腐渣果中豆腐果苷含量的方法，為豆腐渣果的進(jìn)一步應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 豆腐渣果購自成都市荷花池藥材市場；豆腐果苷標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：100385-200401）購自中國藥品生物制品檢定所；色譜純乙腈購自美國 Fisher 公司；重蒸水為成都中醫(yī)藥大學(xué)炮制與制劑教研室自制；微孔濾頭（0.45 μm）購自美國 Millipore 公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器 HPLC 儀（LC-10ATvp 輸液泵、SPD-10Avp紫外檢測器、CT-10ASvp 柱溫箱）為日本島津公司產(chǎn)品；N2000 HPLC 工作站為浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司產(chǎn)品；BP211D 型電子分析天平為德國 Sartorius 公司產(chǎn)品；KQ-400DB 數(shù)控超聲波清洗器為昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；SZ-93 型自動(dòng)雙重純水蒸餾器為上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；DZF-1B 真空干燥箱為上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備和色譜條件 取豆腐果苷標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定 4.70 mg，置 250 ml 量瓶中，加水約 250 ml，超聲處理 5 min 后取出，放冷至室溫，加水至刻度，搖勻即獲得濃度為 18.8 μg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。對標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行全波長掃描，掃描范圍 200～700 nm，結(jié)果顯示在 270 nm處有最大吸收，因此采用 270 nm 作為實(shí)驗(yàn)檢測波長。

參照文獻(xiàn)[4]以及預(yù)試結(jié)果確定色譜條件：色譜柱為菲羅門 Luna-C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-水-冰醋酸（8∶91∶1），流速 1.0 ml/min，柱溫室溫，進(jìn)樣量為 5～10 μl。

1.2.2 HPLC 系統(tǒng)適用性檢測 以上述色譜條件，分別對豆腐果苷樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液（濃度為 18.8 μg/ml）進(jìn)行理論塔板數(shù)、分離度、拖尾因子實(shí)驗(yàn)，各平行實(shí)驗(yàn) 5 次。

1.2.3 方法學(xué)考察

1.2.3.1 樣品溶液制備

⑴提取方法與溶媒種類：參照文獻(xiàn)[4]以及預(yù)試結(jié)果，以水為溶媒，采用超聲提取方法。

⑵提取時(shí)間的考察：取豆腐渣果 100 mg，加入 100 ml水，分別超聲提取 30、45、60 min 制備樣品溶液。

以上述色譜條件分別對提取時(shí)間 30、45、60 min 三個(gè)水平進(jìn)行考察，各平行實(shí)驗(yàn) 3 次。

⑶取樣量的考察：分別取豆腐渣果 60、80、100 mg，加入 100 ml 水，超聲提取 30 min 制備樣品溶液。

以上述色譜條件分別對取樣量 60、80、100 mg 三個(gè)水平進(jìn)行考察，各平行實(shí)驗(yàn) 3 次。

1.2.3.2 專屬性考察 分別配制空白溶液、對照品溶液、樣品溶液，以上述色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.3 線性與范圍考察 取濃度為 18.8 μg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以上述色譜條件進(jìn)樣測定。以進(jìn)樣量（μg）為 X，峰面積（mV·min）為 Y，做線性回歸。

1.2.3.4 精密度考察 取同一豆腐渣果樣品 6 份，各約100 mg，分別加入 100 ml 水，超聲提取 30 min 制備樣品溶液。按照上述色譜條件，平行測定 6 次。

1.2.3.5 穩(wěn)定性考察 分別取樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液（濃度為 18.8 μg/ml），按照上述色譜條件，對穩(wěn)定性進(jìn)行考察。

1.2.4 樣品含量測定 取 6 份豆腐渣果樣品，各約100 mg，精密稱定后置于 100 ml 量瓶中，加水約 100 ml，超聲處理 30 min，放冷至室溫，加水至刻度，搖勻后濾過（0.45 μm），制備樣品溶液，根據(jù)上述色譜條件，分別測定樣品中豆腐果苷含量。

2 結(jié)果

2.1 HPLC 系統(tǒng)適用性

結(jié)果理論塔板數(shù)按豆腐果苷計(jì)算平均為 12003，故確定理論塔板數(shù)按豆腐果苷計(jì)算不應(yīng)低于 8000；分離情況良好，故確定分離度不應(yīng)低于 1.5；拖尾因子平均為 1.01，表明峰型良好；HPLC 儀重復(fù)性指標(biāo)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.30%，表明儀器重復(fù)性良好。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 樣品溶液制備 通過對提取時(shí)間和取樣量的考察，確定提取時(shí)間為 30 min，取樣量為 100 mg（表 1、表 2）。樣品溶液配制方法為：取適量樣品細(xì)粉約 100 mg，精密稱定，置 100 ml 量瓶中，加水約 100 ml，超聲處理 30 min 后取出，放冷至室溫，加水至刻度，搖勻，濾過（0.45 μm）后取續(xù)濾液，即獲得樣品溶液。

表1 樣品溶液制備的提取時(shí)間考察（，n = 3）

表1 樣品溶液制備的提取時(shí)間考察（，n = 3）

時(shí)間（min） 豆腐果苷含量（%）30 1.81 ± 0.0345 1.76 ± 0.0460 1.83 ± 0.08

2.2.2 專屬性考察 HPLC 分析顯示各成分和溶劑之間無干擾，表明該方法專屬性良好（圖 1）。

表2 樣品溶液制備的取樣量考察（，n = 3）

表2 樣品溶液制備的取樣量考察（，n = 3）

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表3 HPLC 測定豆腐果苷的線性與范圍考察結(jié)果

圖1 HPLC 測定豆腐果苷的專屬性考察（A：空白溶液；B：對照品；C：樣品）

表4 HPLC 法測定樣品中豆腐果苷的加樣回收率（n = 3）

2.2.3 線性與范圍考察 結(jié)果表明豆腐果苷在 0.047～0.282 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r = 0.9997），回歸方程為：Y = 3 × 106X + 9245.3（表 3）。

2.2.4 精密度與穩(wěn)定性考察 精密度結(jié)果顯示 RSD 為3.23%，表明該方法精密性較好。穩(wěn)定性結(jié)果顯示樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液的 RSD 分別為 1.04%、1.30%，表明樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液在 12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 回收率考察 結(jié)果顯示樣品的加樣回收率在94.63%～103.59% 之間，RSD為 3.09%（表 4），表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.3 樣品含量測定

采用 HPLC 方法測定 6 份豆腐渣果樣品中豆腐果苷含量，結(jié)果顯示樣品中豆腐果苷含量范圍為 1.68%～1.84%，平均含量為 1.75%（表 5）。

表5 豆腐渣果樣品中豆腐果苷含量的HPLC 法檢測結(jié)果

3 討論

豆腐渣果為云南民間藥材，歷代本草未見記載。豆腐渣果中可能含有與豆腐果苷結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)，結(jié)合含量測定中樣品峰只有一個(gè)單峰的現(xiàn)象，考慮到可能該單峰由豆腐果苷與其結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)所產(chǎn)生，其色譜行為相似，較難分離，且出峰時(shí)間重合，因此需要對該單峰的純度進(jìn)行檢驗(yàn)以鑒別該峰是否僅為豆腐果苷單峰，而不含有其他雜質(zhì)。

為此，照上述的含量測定方法，我們制備了兩份樣品以及一份對照品，采用安捷倫 1200 二極管陣列檢測器對三個(gè)供試品的峰純度進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，通過峰純度檢驗(yàn)判別該峰與對照品純度相似為較純物質(zhì)。這一探索性研究結(jié)果保證了本含量測定方法的科學(xué)性。

綜上，本研究結(jié)果顯示建立的 HPLC 方法精密度高，重復(fù)性及線性關(guān)系良好，回收率滿意，方法科學(xué)、合理、可行，符合簡便、快速、準(zhǔn)確的要求，為豆腐渣果藥材含量測定方法提供了參考，為豆腐渣果提取工藝研究奠定了基礎(chǔ)，也為豆腐渣果的應(yīng)用研究提供了有力支持。

[1]Zhao JP, Pan WE, Chen WX.Studied on the chemical constituents of helicia pyrrhoeotrya.Nat Product Res Dev, 1992, 4(4):35-40.(in Chinese)趙勁萍, 潘維恩, 陳維新.焰序山龍眼植物化學(xué)成分的研究.天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 1992, 4(4):35-40.

[2]Jia MY, Yang YH, Liu JY, et al.The research progress of Helicia nilagirica Bedd.J Traditional Chin Vet Med, 2007, (2):27-29.(in Chinese)賈美艷, 楊永紅, 劉君英, 等.豆腐果的研究進(jìn)展.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志, 2007, (2):27-29.

[3]Zhao JG, Luo RF.Extraction process for helicid from helicid nilagirica beed.Chin J Pharm, 1991, 22(11):485- 486.(in Chinese)趙建國, 羅瑞芳.豆腐果甙提取工藝改進(jìn).中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,1991, 22(11):485-486.

[4]Liu QF, Ye L, Luo GA, et al.HPLC determination of helicidum in helicidum tablets.Chin J Pharm Anal, 26(10):1392-1394.(in Chinese)劉清飛, 葉磊, 羅國安, 等.HPLC法測定豆腐果苷片中豆腐果苷的含量.藥物分析雜志, 2006, 26(10):1392-1394.