HPLC測(cè)定不同商品急性子中槲皮素和山奈酚的含量

佟苗苗，翟延君*，王添敏

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧大連116600）

急性子為鳳仙花科植物鳳仙花Impatiens balsamina L.的干燥成熟種子，始載于《救荒本草》。具有破血軟堅(jiān)、消積的功效，用于癥瘕痞塊、經(jīng)閉、噎膈［1］。《中國藥典》僅有性狀鑒別內(nèi)容，缺少內(nèi)在質(zhì)量控制方法。急性子中含黃酮類化合物［2］，且黃酮類成分化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、藥理作用明確。因此本研究以槲皮素和山奈酚為含量測(cè)定指標(biāo)，對(duì)10個(gè)不同地區(qū)的商品藥材進(jìn)行含量測(cè)定，為急性子的內(nèi)在質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

Agilent 1100高效液相色譜儀（安捷倫科技），紫外檢測(cè)器G2170BA（安捷倫科技），KH-300B型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司），ALC-110.4萬分之一分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），CP225D十萬分之一分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），DZKW-D-2型水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）。甲醇為色譜純，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。槲皮素 （批號(hào) 00081-200406），山奈酚（批號(hào)110861-200808）對(duì)照品均由中國藥品生物制品檢定所提供。急性子商品來源于吉林通化、遼寧丹東、大連、鞍山、新民、河北保定、邯鄲、天津、山東煙臺(tái)、四川成都。經(jīng)本校中藥鑒定教研室翟延君教授鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為 Agilent C18（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相甲醇（A）-0.3%磷酸水（B），梯度洗脫，0～12 min，從45%A線性變化至50%A。檢測(cè)波長為360 nm；流速為1.0 mL／min；柱溫為25℃。理論塔板數(shù)按槲皮素計(jì)算應(yīng)不低于3000。采用此色譜條件，供試品及對(duì)照品色譜分離度良好。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定槲皮素和山奈酚對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含槲皮素0.046 mg，山奈酚 0.001 3 mg。

2.3 供試品溶液的制備 取急性子藥材粉末1 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇-40%鹽酸（5：1）20 mL，超聲提取40 min，放冷，稱重，加甲醇補(bǔ)足重量，濾過，續(xù)濾液經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 分別吸取槲皮素、山奈酚混合對(duì)照品溶液 7，9，11，13，15，17，19μL 注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，槲皮素、山奈酚樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程：槲皮素：Y ＝ 2 187.7X+106.64，r＝0.999 9，線性范圍：0.322～ 0.874μg 山奈酚：Y ＝ 168.47X-45.532，r＝0.999 6，線性范圍：0.009～0.025μg。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密稱取河北邯鄲急性子藥材粉末1 g，依2.3項(xiàng)所述方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定槲皮素、山奈酚的峰面積，計(jì)算RSD分別為0.31%和1.53%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取河北邯鄲急性子藥材粉末1 g，依2.3項(xiàng)所述方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，按 0，2，4，6，8 h間隔進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果槲皮素峰面積的RSD為0.86%，山柰酚峰面積的RSD為2.66%，結(jié)果表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取河北邯鄲急性子藥材粉末6份，依2.3項(xiàng)所述方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果槲皮素和山奈酚平均含量分別為0.051 8%，0.001 0%；RSD 分別為 1.05%，2.17%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的河北邯鄲急性子藥材粉末（0.0322%）1 g，精密加入1 mL的槲皮素、山奈酚混合對(duì)照品溶液（0.5060 mg／mL、0.0105 mg／mL），按 2.3 項(xiàng)所述方法制備供試品溶液，依上述色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定并計(jì)算回收率，槲皮素平均回收率為99.6%，RSD為1.65%，山奈酚平均回收率為 99.0%，RSD為 1.45%。

2.9 樣品含量測(cè)定 精密稱取10個(gè)地區(qū)商品急性子藥材粉末各1 g，按2.3項(xiàng)所述方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液與對(duì)照品溶液各20μL，按上述色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，測(cè)定峰面積，結(jié)果見表1。

表1不同地區(qū)商品中槲皮素、山奈酚含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

本研究首先考察了甲醇-30%鹽酸（5：1）、甲醇-40%鹽酸（5：1）、甲醇-50%鹽酸（5：1）3 種水解溶劑。結(jié)果表明以甲醇-40%鹽酸（5：1）混合液作為水解溶劑時(shí)，所得樣品含量最高，故確定采用甲醇-40%鹽酸（5：1）混合液作為水解溶劑。又以甲醇-40%鹽酸（5：1）混合液為溶劑，比較了回流和超聲方法對(duì)提取率的影響，結(jié)果超聲提取率明顯高于回流。同時(shí)，還進(jìn)一步比較了不同水解時(shí)間對(duì)提取效果的影響，結(jié)果顯示40 min即水解完全。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同產(chǎn)地急性子被測(cè)組分中槲皮素的含量相對(duì)較高，山奈酚含量普遍偏低。而不同產(chǎn)地藥材中槲皮素含量差異較大。這可能與地理位置、生長環(huán)境等因素有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法以槲皮素與山奈酚雙指標(biāo)為對(duì)照，對(duì)全國10個(gè)不同地區(qū)的商品急性子進(jìn)行了含量測(cè)定，建立了內(nèi)在質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)便、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，且重復(fù)性好，可為急性子的品質(zhì)評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

［1］中華人民共和國藥典委員會(huì).中國藥典（一部）［S］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：247.

［2］鞠培俊，孔德云，李小波.鳳仙花化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào) 2007，24（5）：320.