手術標本中結核分枝桿菌檢測及臨床意義研究

吳曉光 陸宇 高孟秋 王子彤 韓鳴 馬麗萍

(北京胸科醫院 北京 101149)

結核病是結核分枝桿菌引起的嚴重危害人民生命健康的慢性傳染性疾病。雖然人類發現結核分枝桿菌是結核病的致病菌已有上百年的歷史,但對結核分枝桿菌生物學本質特別是結核分枝桿菌持留菌的認識仍需不斷深入。臨床上需外科手術治療的結核病患者大多數曾長期反復抗結核治療或未規律系統治療,術中病灶取材進行結核菌培養對于術前化療的判斷以及持留菌的發現都將是很好的切入點。本研究在前期工作的基礎上[1],對手術標本中結核分枝桿菌進行檢測并探討其臨床意義。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 選取本院外科或骨科的住院肺結核、骨結核及淋巴結核患者,有不同療程的化療史,所接受化療方案均含有H RZ,因病程遷延或氣胸等原因行病灶切除治療。

1.1.2 培養基 稱取7H9培養基(美國Difico公司)4.7 g,溶于900 ml蒸餾水中,加入 2.0 ml甘油和0.5ml吐溫-80,121℃高壓10min,待使用前加入0.1體積分數的 OADC營養添加劑(oleic acid albumin dextrose catalase)。

1.2 實驗方法

1.2.1 選取手術標本中肉眼見纖維化、干酪樣病變連同邊緣組織楔形取材,即刻用組織磨碎器研磨,分別接種及-70℃保存待提取RNA用。

1.2.2 取上述處理后標本0.1 ml,系列10倍稀釋后,分別接種到改良羅氏培養基斜面上,每一稀釋度接種 2支,置 37 ℃培養,24 h、72 h、1周 、2周、4周、8周分別觀察生長情況,以8周生長為準計算菌落數目(CFU)。

1.2.3 取0.1 ml接種到含有抗菌素(100 U/ml多黏菌素 B、5μg/ml兩性霉素 B 、25μg/ml羥氨芐青霉素)和0.05%吐溫-80的7H9液體培養基中,分別置37℃進行有氧和低氧(培養基中氧濃度不超過1%)培養 ,24 h 、72 h 、1 周 、2 周 、4 周、8 周定期觀察菌落生長情況。

1.2.4 mRNA的定量檢測 測定結核分枝桿菌異檸檬酸裂解酶(isocitrate lyase,ICL)、小分子熱休克蛋白(alpha-crystalli,ACR)和 85B蛋白 mRNA：RNA提取方法與文獻[2]基本相同。ICL擴增引物：上游 5′-CCATGCGCTGAACTACTCGAT-3′;下游5′-AGT TCGACATACGCGCTCATC 3-′,擴增片段75 bp;結核分枝桿菌ACR和85B擴增引物同文獻[7]。PCR 反應體系 25 μ l,包括10 mmol/L T ris-HCl(pH 值為 8.3)、50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2、200 nmol/L 引物、250 nmol/L 探針、200 nmol/L dNTP、1 U Taq酶(美國Prommega公司)、DNA(cDNA)2 μ l。反應參數 ：95 ℃預變性 5 min,94℃變性30 s,54℃(Acr和85 B為60℃)復性30 s,40個循環。每次反應設陰性對照,未經逆轉錄反應的RNA同時進行聚合酶鏈反應(PCR),監測有無DNA污染。mRNA拷貝數/ml為cDNA拷貝數乘以用于RT及PCR反應時標本液稀釋倍數。不同時間的樣品分別分3份進行mRNA檢測,測定后取均值。

2 結果

2.1 入選病例概況 所選取的12例標本手術前均經一定時間化療后行外科手術治療。其中男性6例,女性6例,病程半年以上至40年不等,化療時間3～36個月,除病例4外其余患者均接受了含H RZ的治療方案3月以上,肺結核患者9例,骨結核患者2例,淋巴結核患者1例,手術前痰結核菌集菌及羅氏培養檢查均為陰性,具體情況見表1。

2.2 檢測結果 將手術切除標本進行羅氏培養、7H9有氧、7H9低氧培養,并檢測標本中結核分枝桿菌ICL、Acr、85B mRNA 的拷貝數,結果見表1。

3 討論

本研究9例肺結核患者術前痰結核菌培養均陰性,術中病灶取材結核菌羅氏培養陽性7例,7H9有氧培養陽性8例,痰標本培養陰性,而手術標本中培養陽性,一方面說明手術標本結核菌培養的陽性率要高,因為培養的結核菌直接來自于病變部位,而非經呼吸道排出;另一方面說明經過一段時間化療或較長時間的臨床病情穩定期(無癥狀、X線胸片顯示病灶穩定)痰培養已陰性并不是真正意義上的結核菌已徹底消除,體內很可能仍然存在具有活性病灶或存在不同代謝狀態的菌群,這樣的檢測對術后的化療起支持和指導作用。本研究因為是初步研究,病例數較少而且我們的藥敏實驗方法也在進行之中,認為對于手術標本結核菌培養陽性者繼續行藥敏測定,將對術后制定個體化抗結核方案有指導意義。本項研究中的7H9有氧培養陰性病例的出現可能與取材或磨碎方法有關,也可能是含菌量少受檢測的限制。

表1 入選病例概況及標本培養檢測結果

一般認為人體感染敏感結核分枝桿菌后,經正規方案(含有HRZ)化療后,體內的結核分枝桿菌一旦進入持留狀態,由于代謝途徑的轉變,使得原來對細菌敏感的藥物變得無效。一系列體外試驗和動物試驗顯示,在低氧、和高濃度藥物的誘導下,一部分結核分枝桿菌為適應環境對其生存的不利影響(在體內條件下還存在有機體免疫系統對細菌的影響),不但形態發生改變,代謝途徑也向乙醛酸支路轉換而進入持留狀態[3-5]。本研究7H9低氧培養陽性8例,其中固體培養陰性而有氧培養陽性的1例(病例7,29歲女性,左上空洞型肺結核,雖經12個月的抗結核治療,但仍有間斷咯血而采取手術治療)。其余均為固體、7H9培養同時陽性,可能的原因是病灶中存在不同狀態的細菌,在體外適宜的條件下生長,也可能是液體培養基中含有復蘇因子使病灶中持留菌復蘇生長[7-8]。

應用定量RT-PCR檢測3種蛋白的mRNA表達,結合培養結果分析：有1例(病例8)是固體培養陰性,液體培養陽性,3種mRNA均有表達且ICL,Acr高表達,根據前期實驗結果可以表明持留菌的存在,85BmRNA的同時表達說明在病灶中也同時存在活躍生長的菌,該病例為15年前患胸壁結核,HRZE化療1年,13年前復發1次,繼續HRZE抗結核藥物治療2年,達到臨床痊愈;本次為第3次病灶復發,對于這種反復復發的病例,一般常規抗結核藥物治療只能殺滅復發后活躍增殖的細菌,對于進入持留狀態的細菌則無效,因此不能達到徹底治愈結核病的目的,應該選用手術治療,徹底消滅體內結核病灶。

臨床上對于結核病復發者,經?？紤]可能存在對一線藥物耐藥,此時多改變方案而采用含左氧氟沙星等的二線藥物治療,但也有部分繼續采用原方案治療再次獲得痊愈的病例存在,根據結核菌持留狀態代謝的特點,結核菌在持留狀態時對藥物不敏感,而一旦復發,結核分枝桿菌又恢復了其活躍增殖的代謝途徑,因此,對結核一線藥物的敏感性也隨之恢復,因此再次應用一線抗結核藥物仍然是有效的,香港的一項臨床研究結果,也證實了結核菌持留狀態的這一特性。況且二線藥物比較一線藥物,價格昂貴、不良反應多,必然為患者帶來了巨大的身體和經濟負擔。

本研究結果表明手術標本是結核菌培養及持留菌檢測的很好材料,對患者術后化療方案有指導意義。由于本研究例數較少和選材及方法的限制,有待進行擴大病例和改進方法的進一步研究,為探索新的抗結核治療提供細菌學基礎和幫助。

[1]陸宇,高孟秋,趙偉杰,王彬 ,馬麗萍,朱莉貞.結核分枝桿菌持留菌感染模型的建立和檢測 [J].中華結核和呼吸雜志,2007(3)：211-215.

[2]陸宇,朱莉貞,段連山,梁桂芳,田苗.mRNA作為結核分枝桿菌活菌檢測標志的可行性研究[J].中華結核和呼吸雜志,2003,26(7)：419-423.

[3]Lucy E.Desjardin,Ladonna G.Hayes.Microaerophilic induction of α-crystallin chaperone protein homologue(hspX)mRNA of Mycobacterium tuberculosis[J].J Bacteriol,2001,183(18)：5311-5316.

[4]Wiker HG,Harboe M.T he antigen 85 complex a major secretion product of Mycobacterium tuberculosis[J].Microbiol Rev,1992,56(4)：648-661.

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[6]Mckinney JD Honer zu Bentrup K,Munzo-Elias EJ.Persistence of Mycobacterium tuberculosis in macrophages and mice requires the glyoxylate shunt enzyme isocitrate lyase[J].Nature,2000,406(6797)：735-738.

[7]Hellyer T J,Desjardin LE,Hehman GL.Quantitative analysis of mRNA as a marker for viability of Mycobacterium tuberculosis[J].J Clin Microbiol,1999,37(2)：290-295.

[8]Hu YM,Butcher PD,Sole K.Protein synthesis is shutdown in dormant Mycobacterium tuberculosis and reversed by oxygen or heat shock[J].FEMS Microbiol Lett,1998,158(1)：139-145.