丹紅注射液對腦缺血再灌注損傷大鼠ICAM-1表達的影響

聞公靈 張寶朝

河南南陽市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 南陽 473009

研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷時的炎癥反應促進了腦梗死的繼發(fā)性腦損害。腦缺血再灌注時在缺血灶局部存在大量炎癥因子,在腦缺血再灌注損傷早期的炎癥反應中可能起重要促進作用。細胞間黏附分子1(ICAM-1)是最重要的白細胞-內(nèi)皮細胞間黏附分子之一,在腦缺血再灌注損傷中的作用成為急性缺血性腦卒中研究的熱點。本實驗將通過觀察丹紅注射液對缺血再灌注腦組織中性粒細胞浸潤和對ICAM-1表達的檢測,探討丹紅注射液對腦缺血再灌注損傷的保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及給藥 選擇體質(zhì)量為270～320 g的健康SD大鼠,雌雄各半(由河南省實驗動物中心提供),隨機分成假手術組(給生理鹽水),缺血再灌注組(給生理鹽水),丹紅(給丹紅注射液2 ml/kg)組,每組 8只,經(jīng)舌下靜脈給藥3 d后制作大腦中動脈栓塞模型。

1.2 動物模型制作 用體積分數(shù)為10%的水合氯醛300mg/kg麻醉,采用 Longa等[1]的線栓法建立大腦中動脈(MCA)閉塞模型。缺血再灌注組及bFGF組均給予缺血1 h再灌注24 h,屆時灌注取腦、固定、脫水、透明、包埋。假手術組除不插線外,余同上。

1.3 免疫組織化學染色檢測ICAM-1 采用SABC法,石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,過氧化氫封閉,抗原熱修復 20min,血清封閉,滴加1∶100兔抗ICAM-1抗體(購自博士德生物公司),4℃過夜,0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate bufferad satine,PBS)洗,滴加生物素化的羊抗兔IgG 37℃孵育1 h,PBS洗,滴加ABC復合物37℃孵育 1 h,PBS液洗,DAB顯色,鏡下控制反應時間,雙蒸水終止反應,脫水、透明、封片、顯微鏡觀察。10×40倍光鏡下,在缺血區(qū)計數(shù)5個視野,計數(shù)陽性微血管數(shù)(血管內(nèi)皮細胞胞漿、胞膜被染成棕黃色顆粒狀),取其均值,以陽性微血管數(shù)/高倍視野表示。

1.4 HE染色觀察白細胞浸潤計數(shù) 腦組織常規(guī)切片HE染色,每張切片用10×20倍顯微鏡下隨機選取缺血區(qū)內(nèi)的5個視野,進行白細胞計數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 12.0統(tǒng)計分析軟件進行處理,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差()表示,組間比較采用 t檢驗。取α=0.05作為檢驗水準,以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計學意義的標準。

2 結(jié)果

2.1 缺血再灌注腦組織ICAM-1陽性表達血管的變化及丹紅對其的影響 假手術組未觀察到ICAM-1陽性微血管,缺血再灌注組(27.40±5.86)可見較多ICAM-1陽性微血管,在腦組織切片中ICAM-1免疫陽性染色可見于微血管的內(nèi)皮細胞上,明顯的免疫陽性染色出現(xiàn)在缺血再灌注側(cè)半球,并主要局限于缺血區(qū)。丹紅組ICAM-1(20.93±4.89)陽性微血管數(shù)較缺血再灌注組明顯減少(P＜0.05)。

2.2 缺血再灌注腦組織白細胞浸潤的變化及丹紅對其的影響 假手術組未見白細胞的浸潤。缺血再灌注組白細胞(9.53±2.47)浸潤明顯增加,其浸潤主要集中在缺血梗死灶的周圍。丹紅組(7.15±2.55)在腦缺血1 h再灌注24 h白細胞浸潤的水平較缺血再灌注組明顯降低(P＜0.05)。

3 討論

大量研究證實急性缺血后恢復血流灌注可加重細胞損害,其發(fā)生、發(fā)展與ICAM-1的作用密切相關。在腦缺血再灌注時,血管內(nèi)皮細胞和白細胞上細胞間黏附分子-1表達升高,白細胞和內(nèi)皮細胞的黏附力增強,造成白細胞大量牢固黏附,白細胞集聚阻塞微血管,并釋放大量的炎性介質(zhì)和細胞因子,加重腦組織損傷,并吸引更多的白細胞進入組織,形成惡性循環(huán)。Yang等[2]研究發(fā)現(xiàn)大鼠永久性大腦中動脈閉塞后24h,缺血區(qū)皮質(zhì)ICAM-1表達顯著升高,與病灶中心區(qū)相比,損傷較輕的周邊區(qū)有濃密的ICAM-1陽性血管分布。研究還顯示ICAM-1在后毛細血管內(nèi)皮優(yōu)先表達的位置與缺血再灌注相關部位的白細胞黏附和水腫形成及粒細胞炎癥期移行位置相一致。Chop等[3]在大鼠腦缺血再灌注前應用抗ICAM-1單克隆抗體,發(fā)現(xiàn)缺血2 h再灌注48 h腦梗死體積明顯降低。應用中性粒細胞抑制因子能明顯減輕大鼠腦缺血再灌注后缺血半球的腦梗死體積、腦水腫和神經(jīng)病學癥狀[4]。本實驗應用免疫組化法檢測了缺血1 h再灌注24 h腦組織ICAM-1的表達,在損傷區(qū)皮質(zhì),假手術組未見ICAM-1陽性微血管,缺血再灌注組可見較多的ICAM-1陽性微血管,在病灶區(qū)及半暗帶區(qū)均可見到,應用HE染色觀察缺血區(qū)白細胞浸潤情況,結(jié)果顯示缺血再灌注組白細胞浸潤明顯增加,其浸潤主要集中在缺血梗死灶周圍,與ICAM-I高表達區(qū)域一致。在ICAM-1表達較多的區(qū)域,形態(tài)異常神經(jīng)元增加,細胞間質(zhì)水腫明顯,說明ICAM-1參與了腦缺血再灌注損傷的病理生理過程。

丹紅注射液是由丹參和紅花兩味藥材按科學配方提取的復方中藥制劑,具有活血化瘀、通脈舒絡之功效,在腦血管疾病方面應用廣泛,但對其復方制劑研究較少,以往的研究多著眼于單味中藥從抗氧化、抗血栓形成等角度進行研究[5-6]。本實驗著眼于復方制劑從阻抑粒細胞黏附角度出發(fā),探討丹紅注射液腦保護作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)丹紅組缺血區(qū)雖仍有較多ICAM-1陽性微血管,但較缺血再灌注組相比明顯下降(P＜0.05),腦缺血1 h再灌注24 h白細胞浸潤水平較缺血再灌注組明顯降低(P＜0.05),表明丹紅注射液可抑制缺血再灌注后腦組織ICAM-1的表達,減輕白細胞浸潤。

綜上所述,腦缺血再灌注病變時炎性細胞的激活、浸潤及黏附分子的合成分泌呈一種相互增強相互促進的級聯(lián)反應,ICAM-1介導了白細胞和內(nèi)皮細胞的黏附及向腦缺血區(qū)浸潤過程,丹紅注射液可以降低缺血再灌注腦組織中性粒細胞的浸潤及ICAM-1的表達,提示丹紅注射液可能激活了機體的內(nèi)在保護作用,阻斷了腦缺血再灌注損傷時的炎性級聯(lián)反應,從而發(fā)揮了保護作用。

[1]Longa EZ,Weinsein P R,Canson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion withcraniectony in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-88.

[2]Yang GY,M ao Y,Zhou LF,et al.Attenuation of temporary focal cerebral ischemic injury in the mouse following transfection with interleukin-1 receptor antagonist[J].Mol Brain Res,1999,72(2):129-137.

[3]Chopp M,Li Y,Jiang N,et,al.Antibodies against adhesion molecules reduces apoptosis after transient middle cerebral arteray acclusion in rat brain[J].J Cereb Blood Flow M etab,1996,16(5):578-584.

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[5]王淑君,王萬鐵,熊建華,等.紅花注射液對腦缺血一再灌注損傷家兔血漿 TXA2/PGI2水平的影響[J].中國現(xiàn)代應用藥學雜志,2003,20(2):100-102.

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