生化標志物MMPs、HSP27、OX-LDL與冠心病相關性的研究

張兆志 孟曉萍

1 基質金屬蛋白酶(MMPS)

基質金屬蛋白酶(MMPs)是一組鋅依賴性內肽酶，到目前為止，至少發現26種MMPs，其中在人體中已經發現23種MMPs。MMPs被分成6個家族分別為:膠原酶、明膠酶、基質降解酶、基質溶解因子、MT-MMPs、其他 MMPs［1］。MMPs 能降解所有的細胞外基質成分，參與脂質堆積到斑塊進展、血栓形成的整個過程［2］。

基質金屬蛋白酶(MMPs)參與動脈粥樣硬化的形成近年來，對解釋動脈粥樣硬化形成的“內皮損傷反應學說”的研究越來越多的涉及到了MMPs。證據表明，長期高脂血癥使動脈內膜造成功能性損傷，炎細胞的浸潤分泌多種炎性反應因子和脂質過氧化物誘導內皮細胞分泌MMP-2，MMP-9降解基底膜，加速低密度脂蛋白滲透，有利于單核細胞入侵，并與內皮細胞黏附，使內皮細胞轉變為泡沫細胞，這是動脈粥樣硬化發生的關鍵環節之一。此外，在泡沫化過程中多種細胞因子調節其他細胞分泌大量MMPs進一步降解細胞外基質，促使脂質條紋的形成并加速粥樣斑塊的發展［3、4］。人體模型已發現MMPs的激活有利于血管平滑肌細胞通過內源性的彈力層到達內膜，并復制擴增，導致斑塊形成，促進動脈粥樣硬化的發生，并且通過MMP抑制劑(MatrixMetall opro-teinases inhibitor，MMPi)或者轉基因治療可延緩其發生。

基質金屬蛋白酶(MMPs)參與動脈粥樣硬化的進展及促進動脈粥樣硬化板塊的破裂在泡沫化過程中多種細胞因子調節其他細胞分泌大量MMPs進一步降解細胞外基質，促使脂質條紋的形成并加速粥樣斑塊的發展，被激活的MMPs降解纖維帽的基質結構是斑塊不穩定的主要因素。而且MMPs能協同作用使細胞外基質徹底降解。間質膠原酶MMP-1和MMP-8能協同降解纖維單環，導致三股螺旋展開，這種形成單鏈的明膠酶可被MMP-2和MMP-9進一步降解成寡肽［3］。研究發現MMP-l、MMP-2、MMP-3、MMP-9的分解活性多位于人的動脈粥樣斑塊肩區，脂質邊緣［6、7］。ACS患者血漿MMP-2和MMP-9水平是顯著升高的。大量實驗研究證實，心肌梗死時大量釋放的生長因子和細胞因子可上調MMPs轉錄水平。此外，應激狀態下蛋白水解酶產生的瀑布式放大效應可逐級括化 MMPs［8］。

MMPs的抑制劑基質金屬蛋白酶參與許多病理生理過程中，MMPS在相當長的時間已經被作為藥物干預的靶點。TIMPs是特異的內生抑制因子與 MMPs1:1相對應。4種TIMPs(TIMP-1、-2、-3、-4)在脊髓動物已經被確定［9］。除了TIPM-1不能抑制MT1-MMP外，TIMPs能抑制所有的MMPs已經被驗證。人工合成的光譜血漿MMP抑制劑包括氧肟酸派生的抑制物，例如:BB-94(巴馬司他)、BB-1101、BB-2293、BB-2516、CT1746(馬立馬司他)是競爭性MMP抑制劑。Ro-28-2653選擇性抑制 MMP-2、-9、MT1-MMP;Ro-28-3555 選擇性抑制MMP-1，IW449選擇性抑制MMP-2［9］。實驗性研究已經表明去氧土霉素在降低腹主動脈瘤有明顯效果，這也使對于抑制動脈粥樣硬化斑塊應用MMPs抑制劑有了更好的興趣［10］，TIMPs通過基因過表達已被證明可減少MMP的活性并且降低內膜增厚［11］。過表達的TIMP-1在動脈粥樣硬化的老鼠模型中顯示了能減輕病變的作用。最近研究驗證RAdTIMP-2能減少動脈粥樣硬化斑塊病變［12］。針對MMPs轉錄水平調控和翻譯水平酶活性調節的單克隆抗體以及特異性強、副反應小、高效能的抑制MMPs制劑會廣泛用于臨床來預防和治療冠心病患者。

2 熱休克蛋白27ab(HSP27ab)

原核和真核生物在受熱、接觸毒物和其他各種應激因素(如一氧化碳、煙堿、缺氧、重金屬離子、紫外線照射等)后都可以發生熱應激反應，誘導合成一組高度保守的蛋白質-熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)。熱休克蛋白可以作為分子伴侶(mol-ecular chaperones)，介導蛋白質分子內或分子間相互作用，并與新生、未折疊、錯誤折疊或聚集的蛋白質相結合，使某些蛋白質解離，減少產生不溶性聚集物的危險性，參與變性蛋白質的清除，賦予細胞或生物從各種應激中恢復的能力，使其獲得熱耐受或毒物耐受。根據其分子量的不同，人們把熱休克蛋白分為多個家族，從10kD到150kD，如小分子HSP家族、HSP60、HSP70、HSP90、HSP110 等。HSP27 是小分子家族中的一員，是一種分子量約為27Kda分子，且在各種各樣的腫瘤和正常組織中(包括心臟組織中高表達，而且它作為一種分子伴侶HSP27YO有許多潛在重要的生物特征，包括細胞凋亡，參與血管平滑肌移行、增殖、胚胎發生、心血管保護抵抗、氧化應激、炎性反應調節，在心肌保護方面擔當重要的角色［13］。

HSP27在哺乳動物的心肌細胞中可被測量到，并且可被氧化應激所激活。他作為分子伴侶保護其他蛋白質合成過程中多肽的折疊與展開，從而形成有功能的蛋白;幫助新合成的蛋白質移位或轉運到相臨的靶器官，或通過分泌途徑釋放。而且幫助維持細胞骨架，這種相關性是相當重要的:第一、HSP27已經被顯示在單細胞中具有穩定每種細胞骨架結構，增強細胞對壓力的抵抗;第二、心肌不可逆的缺血損傷被認為包括嚴重的對細胞骨架支持系統的損害［14］。在心肌保護方面HSP27可能有許多獨特的保護途徑，例如，增強HSP27表達已經顯示了引起抗氧化型谷胱甘肽在細胞水平上的增加，同時降低脂肪酸合成酶/載脂蛋白-1介導的編碼性細胞死亡。相反降低HSP27表達已經表明降低谷胱甘肽水平和程序性細胞死亡的增加的結果。HSP27能黏附并保護這些細胞免受損害［13、15］。在許多不同的模擬缺血/再灌注損傷，從試管細胞到轉基因老鼠，都報道過HSP27的心肌保護作用［15］。

以前的研究表明，高血漿抗體HSP-60/65和70/75水平與心血管疾病的嚴重程度和進展有強的相關性，這已經在實驗動物和人的動脈粥樣硬化血漿中表達并得到證實。從實驗動物和人的研究中有較好的證據表明心血管疾病存在高水平的HSP60/65、HSP 70/75抗體［16］，但HSP27在動脈粥樣硬化中的角色數據有限。HSP27抗體已經在冠心患者的血漿中被確定。幾個研究已經報道:在梗死心血管組織中HSP27的表達增高，并且在心肌梗死、缺血幾個小時釋放入血。Ran等［28］通過新西蘭大白兔的心肌缺血或缺血再灌注試驗中發現HSP27的血漿濃度明顯增高，在心肌保護方面起了重要作用，它可抑制心肌細胞死亡。Hollander等［17］研究表明ACS患者HSP27的血漿水平明顯增加。Shams等［18、19］通過檢測急性胸痛(包括AMI、UA)患者2～12 h內HSP27的血漿濃度，發現HSP27的血漿濃度明顯高于對照組，而且研究顯示HSP27的血漿濃度與血壓和年齡有強的相關性，與其他已確定的冠心病風險因素無關。Kardys等［20］對510名健康女性隨訪5.9年，發現發生冠心病與未發生冠心病事件的人群基礎HSP27的濃度與冠心病事件無關，從而得出結論:HSP不能作為冠心病的危險因素及預測指標。HSP27在心血管疾病中究竟擔當何種角色，在心肌損傷中保護作用及其能否作為冠心病的危險因素及能否預測在缺血性心肌病的預后眾說紛紜，尚無定論。

3 氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)

從8O年代開始，越來越多的資料表明動脈粥樣硬化與天然低密度脂蛋白通過Brown/Goldstein LD受體的攝取關系不大，而與一些修飾的LDL通過一種或多種其他受體的攝取關系密切，而其中最確切的是OX-LDL［21］。動脈粥樣硬化形成的一個基本特性是，許多源于巨噬細胞的泡沫細胞在動脈內皮下蓄積。這些泡沫細胞中的膽固醇和膽固醇酯來源于OX-LDL。體內動脈粥樣硬化病變處的主要細胞:內皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞和淋巴細胞均可氧化LDL。OX-LDL被巨噬細胞迅速攝取是由其清道夫受體介導，清道夫受體攝取OX-LDL不受細胞內膽固醇濃度的負反饋調控，其結果是巨噬細胞內大量脂質聚集形成泡沫細胞［22］。OX-LDL通過六種機制參與的AS形成:①趨化作用，促進循環中細胞黏附于血管內皮以及單核細胞進入內皮下層;②抑制AS病灶中巨噬細胞游走及返回血液循環;③增加巨噬細胞攝取LDL的速度，形成泡沫細胞;④細胞毒作用，使內皮細胞功能狀態發生改變，內皮細胞通透性增加，甚至導致內皮細胞脫落;⑤OXLDL有很高的免疫原性，可刺激機體產自身抗體，并在AS病灶中與抗體結合成免疫復合物，該復合物被吞噬細胞的Fc受體快速攝入;⑥影響一些細胞因子如腫瘤壞死因子(TNF)一Q、白細胞介素(IL)一l的表達，使AS病變向復合病變發展。在動脈粥樣硬化早期病變中就可檢測到OX-LDL，OX-LDL主要存在于泡沫細胞中。這與Braun等［23］用抗OX-LDL抗體對兔動脈粥樣硬化脂紋期病變，進行免疫組化染色所得的結果一致。在動脈粥樣硬化病變晚期，免疫組化分析顯示OX-LDL越來越多地沉積于細胞外基質中，尤其是纖維帽區、脂質核心及粥樣壞死區。定量檢測結果也表明，動脈粥樣硬化病變越到晚期，OX-LDL含量越高。由于膽固醇及OX-LDL的毒性作用，細胞逐漸衰老死亡，釋放出大量OX-LDL并沉積于組織中，進一步促進動脈粥樣硬化的進展。Michinori等［24］選擇115例冠心病患者(其中 ACS94例、SAP23例)發現，ACS(2.95 mg/dl)比SAP(1.53 mg/dl)有更高的血漿OX-LDL水平(P=0.002)，而且認為血漿OX-LDL水平可作為CHD和ACS發展的標志物。

OX-LDL通過加強炎性反應導致斑塊不穩定。目前研究表明，炎性反應引起動脈粥樣硬化斑塊穩定性降低導致斑塊破裂，是急性冠脈綜合征的重要發生機制。LDL被氧化修飾形成OX-LDL后可激活血管內皮細胞使其表達細胞黏附分子，促進炎性細胞的黏附和浸潤;能刺激炎性細胞表達基質金屬蛋白酶，使纖維帽內細胞外基質降解，削弱纖維帽抗損傷能力。從而增加斑塊易損性，易引發冠脈綜合征。Ravnskov等［25］報道，在正常健康人和動脈粥樣硬化患者體內均有OXLDL的抗體，主要成分為IgG，極少量IgM。OX-LDL能刺激相應的B細胞克隆，經活化、增殖、分化，成為分泌免疫球蛋白的漿細胞，分泌針對OX-LDL抗原決定簇的IgG。抗Ox-LDL抗體不僅反映0X-LDL的存在，而且其本身與Ox-LDL形成的免疫復合物(immune complexes，IC)在動脈粥樣硬化的發病機制中具有重要作用。Brizzi［26］報道，在AS病灶內發現:通過C3b將抗OX-LDL抗體與內皮細胞上0X-LDL黏附形成大分子的免疫復合物，然后被巨噬細胞吞噬，該復合物能進一步激活補體系統引起和加強炎性反應。

降低OX-LDL血漿水平，從而抑制動脈粥樣硬化進展、穩定斑塊是動脈粥樣硬化新的治療靶點。OX-LDL是主要的致動脈粥樣硬化因素之一，降低OX-LDL血漿水平在抗動脈粥樣硬化方面有很好前景［27］。生活方式的改變是降低低密度脂蛋白的基礎，例如:低脂飲食、控制血壓水平、攝入新鮮蔬菜水果、戒煙、減輕體重、運動等。Linna等［28］調查164個志愿者，年齡在40～70歲之間，吸煙者33人有更高的OX-LDL血漿水平(21%)(P＜0.05)相對于不吸煙者131人。高血壓與血漿OX-LDL水平呈明顯相關性。維生素及胡蘿卜素是天然的抗氧化劑，飲食中補充這些物質可增強抗氧化能力，但維生素E可損傷內皮的舒張功能，補充它并沒有證明可防治冠狀動脈粥樣硬化。他汀類調脂藥通過抑制內皮上的LOX-1(血凝素樣的氧化低密度脂蛋白受體)表達，而減少內皮細胞攝取OX-LDL［29］。體外試驗已證實，辛伐他汀可顯著抑制OXLDL誘導的巨噬細胞生長，減少動脈粥樣硬化早期來源于血單核/巨噬細胞的泡沫細胞的數量。HPS試驗是目前世界上最大的有關降膽固醇(辛伐他汀，40 mg/d)和補充抗氧化維生素(維生素E 600 mg/d，維生素C 250 mg/d，胡蘿卜素20 mg/d)的研究，評價兩者對冠心病高危人群總死亡率和特定原因死亡率的影響。結果顯示，前者能顯著降低主要血管事件的危險性，而后者不能降低主要心臟事件和其他冠心病的危險性，與安慰劑相比無明顯差異。阿司匹林在體外、體內都可保護LDL免遭氧化修飾，這為阿司匹林預防冠狀動脈粥樣硬化提供額外機制。阿司匹林通過增強PPARalpha/gamma和TIMP基因在被OX-LDL活化的巨噬細胞的表達而抑制MMP-2和MMP-9的表達，從而起到穩定斑塊的作用［30］。普羅布考是人工合成的抗氧化劑，可保護LDL免遭氧化修飾，降低OX-LDL的血漿水平，同時能降低血漿中的MMPs，起到穩定斑塊的作用［31］。

MMPs、HSP27、OX-LDL等生化標志物均參與冠狀動脈粥樣硬化的發生、發展。大量循證醫學證據已經提示各種生物標記物在冠心病的預測及預后判斷中均具有一定作用，但其中絕大多數尚不能單獨應用于臨床。聯合應用兩種或兩種以上的生物標記物可能提高生物標記物在冠心病的預測及預后中的價值。

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