基因疫苗的發展及其展望

劉斌忠 錫林郭勒職業學院 草原生態與畜牧獸醫系 026000

基因疫苗,也稱DNA疫苗、核酸疫苗，其作用機理是將含有可表達的病原微生物的抗原基因整合到某種適宜的質粒DNA中，然后將這種質粒DNA直接注射到動物體內，使抗原基因利用動物細胞進行內源性表達，從而誘發機體產生特異性免疫反應，形成針對病原微生物的免疫保護作用。

1 基因疫苗的優缺點

目前生產上普遍使用的疫苗仍然是傳統的滅活疫苗。這是因為滅活疫苗安全，易隨時制備，但其病毒抗原不能在體內增殖，故接種劑量大，免疫時間短，且誘發細胞的免疫作用不強。而弱毒疫苗則具有相當的優勢，能在動物體內進行有限的增殖，用量小，成本低，適宜作大量的動物免疫接種，且能誘導細胞免疫，使機體產生強而持久的免疫保護力，但存在毒力不穩定的問題，實踐證明有時弱毒疫苗能夠構成傳染源，引起疫病流行。由于已有的疫苗存在不少缺點，因此人們一直希望能找到一種更為理想的疫苗?；蛞呙缂染哂袦缁钜呙绲陌踩?，又具有弱毒疫苗的高效性，故很快便在各種疫苗中脫穎而出，倍受廣大研究者的青睞。

2 基因疫苗存在的問題

2.1 接種方式目前已知的接種方法有兩類

一是利用基因槍將質粒DNA直接注入皮下、腹膜內及骨骼肌等組織；

二是利用高壓放電作用，將質粒DNA涂布于金顆粒上，再通過基因槍將其射入相應的組織與器官。而對規模化、集約化的養殖場而言，這兩種方法顯然都不太適宜，最好能夠研制出相應的口服疫苗或氣霧性疫苗，這樣在接種時就方便簡單、省時、省力。

2.2 接種劑量

基因疫苗同其他疫苗一樣，接種量少，抗原基因表達和提呈的抗原蛋白就少；接種量大，抗原基因表達和提呈的抗原蛋白就多。又因為其能夠持久表達，因此很可能會產生各種免疫副作用，如免疫耐受、自身免疫、免疫變態反應等。

2.3 接種途徑Fynan用50～300微克的含甲型流感病毒的HA基因的純化DNA接種2次后,用致死量的同一病毒毒株進行致毒,結果表明經肌注、靜脈注射以及粘膜免疫的雞，其保護率分別為25%～36%、24%、30%。由此可見，不同的組織細胞攝取質粒的能力不同，不同細胞的傳染效率和表達外源性基因的能力也存在著差異。

2.4 基因疫苗載體的選擇---質粒DNA應不具有傳染性,在體細胞內不能復制,不可整合到細胞的染色質上,但必須能在相應的細菌中高效率地擴增和使其攜帶的外源基因能高效率地表達抗原蛋白,以誘導產生強而持久的免疫保護力。

3 基因疫苗的免疫機制

隨著基因疫苗的誕生，國內外學者對其免疫機制也進行了許多研究，但由于研究時間短，故對其具體機制尚不清楚。目前主要有以下兩種觀點：

3.1 利用基因槍經皮膚或粘膜接種后,認為在表皮細胞內有專職抗原提呈細胞APC（酸性磷酸酶）如朗罕氏細胞等參與活化機體免疫的過程。

3.2 經肌肉接種后，DOE.B等首次證實骨骼來源的APC可將表達的抗原提呈給T細胞，誘導出相應的CTL（抗腫瘤細胞毒T淋巴細胞）反應。

4 基因疫苗的安全性評估

基因疫苗受到了廣大研究者的關注，同時對于其使用安全性也進行了一系列的研究，目前主要關心的問題有：

4.1 引起免疫功能紊亂的可能性基因疫苗能在動物機體內持久地表達抗原蛋白,從理論上來說，很可能導致免疫耐受、自身免疫、超免疫性等免疫病理現象的發生。但至今在性成熟動物中尚未有相關的報道，而在初生動物，Mor.G等將含瘧疾環狀子孢子蛋白基因接種2-5天的小鼠，產生了特異的免疫耐受狀態；Wang.Y等將狂犬病毒糖蛋白基因接種出生24小時的小鼠卻誘導出了較強的免疫應答。由此可見，動物機體免疫系統的功能狀態，質粒及抗原的選擇與接種后產生的免疫效果有一定的關系。因此為了盡量避免產生免疫病理現象，應考慮選擇合適的抗原和載體質粒DNA以及動物的接種齡期。

4.2 外源基因隨機整合的可能性質粒DNA及其攜帶的外源基因進入宿主細胞后，很可能與細胞內的遺傳物質隨機整合，從而致癌。但已有的研究表明，整合的可能性極小。首先基因疫苗注射時，接種量相當小，故整合的幾率微乎其微；其次Nichols.W等直接利用PCR（聚合酶鏈反應）方法檢測肌肉接種后細胞中的質粒DNA，未發現整合。Istwan.D等經實驗證實質粒DNA進入細胞后并不復制。另外，畜禽生產周期短，因整合而帶來的危害性更小，甚至可以不予考慮。

4.3 抗DNA抗體產生的可能性曾有報道,在人的自身免疫病(如全身紅斑狼瘡)曾發現了抗體DNA，故許多人擔心使用基因疫苗后，可能會產生抗DNA的抗體。Psetsky.Y認為利用細菌DNA免疫接種，可以產生抗哺乳動物ssDNA（變性DNA）抗體，但不產生抗哺乳動物dsDNA（成雙堿基對的DNA）抗體。Xiang.Q等則在實驗中根本沒有檢測到抗DNA的抗體。一般來說，能夠作為免疫原的DNA必須具備復雜的結構和較大的分子量，故在制備質粒DNA疫苗時，應考慮所用質粒DNA的結構、分子量的大小及核苷酸的序列等因素。當然為了確診基因免疫后能否真正產生抗DNA的抗體，還有待更進一步的研究。

5 基因疫苗的接種方案和途徑

5.1 接種方案。DNA疫苗接種的普通方案是連續注射多次,間隔2-3周,但這種接種方案是可改進的。實驗證明，將DNA疫苗與蛋白質疫苗交替注射有可能獲得更好的免疫效果。例如給猴子接種HIV-I DNA疫苗以后，再用重組HIV-1（人免疫缺陷病毒I型）的Env（株外膜）蛋白作兩次加強注射，結果誘導很好的B細胞和T細胞免疫反應。又例如在結核桿菌DNA疫苗的研究中，如果預先給動物接卡介苗，再注射DNA疫苗作為加強劑，對預防原發性結核桿菌復燃會更有效。

5.2 接種途徑。范泓然在1999年發現,DNA疫苗可以通過毛孔進入皮下組織,使小鼠體內產生抗乙肝病毒表面抗原的特異性抗體,其效果可以和通常所用的肌肉注射相媲美。

6 基因疫苗和基因免疫的意義和應用

6.1 在理論方面,基因疫苗和基因免疫開創了免疫學的新領域，提出了一個全新的概念，成為當前研究的熱點，是最具挑戰性的研究方面。隨著基因免疫研究的深入，人們將能夠了解病原體與疾病免疫的確切關系，知道一種病原體各種成份誘發了何種免疫成份的產生。同時有助于更好地理解效應免疫的機制。在實際應用方面，基因疫苗也有重要的意義。①基因疫苗的第三次革命。這種第三代疫苗將為預防傳染性疾病和腫瘤的基因治療等開辟了新的道路。它使疫苗的制備更加科學合理，通過研究可以知道哪些基因應當包括進DNA疫苗，篩選出能夠誘導出保護性免疫的抗原成份。②利用基因免疫研究單個蛋白質誘導特異免疫反應。分離或合成某個蛋白質的基因，制備出基因疫苗，研究其初次免疫應答的機制。③基因免疫是生產單克隆抗體的有用技術。先分離相應的基因，構建真核表達載體、免疫后得到抗體。

6.2 基因疫苗研究的主要應用：①復雜微生物、寄生蟲免疫的制備。如結核桿菌瘧原蟲的抗原成份復雜，難以純化。通過擴增有效抗原成分相對應原基因片段，就要簡單得多。②易于變異的微生物，特別是病毒疫苗的制備，如HBV（乙型肝炎病毒）、HCV（丙型肝炎病毒），流感病毒。③制備難以培養或危險的微生物疫苗，如HIV （人類免疫缺陷病毒），HDV（丁型肝炎病毒）。④持續病毒感染的預防：LCMV（淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒）、HSV（單純皰疹病毒）。⑤新生兒、兒童免疫接種。⑥胞內寄生清除，腫瘤免疫的有效途徑。由于基因疫苗能夠有效刺激CTL（細胞毒性T淋巴細胞）產生，所以在細胞免疫方面有重要意義。

7 基因疫苗的國內外研究概況及展望

自基因疫苗問世以來，國內外學者便對其免疫機制、免疫效果、接種方式、使用劑量、安全性及目的基因表達調控等進行了廣泛而卓有成效的研究。在人醫方面，愛滋病、人免疫缺陷性病毒及T淋巴瘤的基因疫苗已進入了臨床應用階段，流感病毒、結核病、乙型肝炎、丙型肝炎、乳腺癌、肺癌、狂犬病等的基因疫苗也正處于研究之中。在獸醫方面，國外已有關于禽流感和新城疫的基因疫苗的報道。在我國，李建偉等報道了基因免疫誘導雞對MDV（馬立克氏病毒）的保護性反應。哈爾濱獸醫研究所的陳化蘭等報道了基因免疫可誘導SPF（無物定病原）雞抵抗禽流感病毒感染，這些工作為我國畜禽基因疫苗的研究作出了有益的探索。

基因疫苗與其它新技術疫苗相比具有很多優越性，尤其對于養禽業來說更具有實際意義。眾所周知，很多傳染病的病原具有多個血清型或變異株，例如，一旦爆發IBD（雞傳染性法氏囊）或AI（禽流感），我們就可以迅速分離病原，克隆其免疫基因，制備針對該病原型的基因疫苗，因而對防治該病更具有針對性。由于常規的基因克隆技術已經可以在一般實驗室開展，從某種疾病的爆發到疫苗的制備僅需1-2天即可完成，從這個角度看對基因疫苗的研究應該投入更多的精力。然而，目前對于基因疫苗的研究還相當有限，尤其是在獸醫方面，可以說才剛剛起步。有關基因疫苗的質粒選擇，與目的基因調控有關的啟動子、增強子、內含子和免疫佐劑等的選擇，多個目的基因克隆進同一載體后是否產生干擾現象，以及經不同途徑接種后引起的免疫效果和免疫機制機理等許多問題還有待解決，而一旦這些問題得到了成功的解決，那么就可以設計研制出大量理想的基因疫苗，為養禽業的穩定發展作出不可估量的貢獻。

[1]Curtiss R I,Cardineau CA·O ral immunization by transgenic plants 〔J〕·W orld Plant Application,1990,90：107-111

[2]董偉,易自力·轉基因植物口服疫苗研究進展〔J〕·動物醫學進展·2005,26(6)：6-8

[3]任雪艷,陳創夫等·轉基因植物基因工程疫苗的研究進展〔J〕·草食家畜(季刊),2004：125·

[4]葛莘·高級植物分子生物學〔M〕·北京：科學出版社,2004：93-95·

[5]黃復深,袁鑫,邱元·植物基因工程疫苗研究進展〔J〕·湖南農業大學學報 (自然科學版)·2008,34(2)：215-220·

[6]閆桂琴·生命科學技術概論〔M〕·北京：科學出版社,2003：88-91·

[7]田佳,賈會勇,李杰·植物可食疫苗研究現狀與展望〔J〕·中國生物制品學雜志,2008,21(7)：637-640

[8]劉一萍,邵中軍,徐德忠,等.HBsAg陽性孕婦及其新生兒用HBIG對乙型肝炎病毒母嬰傳播的阻斷效果觀察[J].疾病控制雜志,2004,8(2)：109-111.

[9]王克恭.基因免疫—傳染病防治研究的新熱點[J].畜牧與飼料科學，1998，19（2）：45-47