肺鱗癌蛋白質組學研究現狀

曾劍 金龍玉 劉建新

肺鱗癌蛋白質組學研究現狀

曾劍 金龍玉 劉建新

肺鱗癌的蛋白質組研究是探析肺鱗癌發病機理的重要方法之一，能為肺鱗癌的臨床診斷、治療以及預后判斷提供重要信息。目前對肺鱗癌的蛋白質組研究取得了許多成果，本文就此做一綜述。

肺癌；鱗狀細胞癌；蛋白質組；診斷；預后

肺癌是目前全球發病率最高的惡性腫瘤之一，其中以鱗癌最為常見，約占全部肺癌例數的30%～50%。隨著蛋白質組學技術的發展及其在肺癌研究中的應用，對肺癌的蛋白質組學研究取得了許多重要的成果。肺癌包括多種類型，每種類型的病因、機理及其分子生物學行為均有所不同，須分別予以研究探討，本文就現階段肺鱗癌的蛋白質組學研究的現狀進行綜述。

1 肺鱗癌蛋白質組學及其相關技術

肺鱗癌的蛋白質組學研究是指應用大規模蛋白質分離和鑒定技術，研究肺鱗癌癌細胞在特定時間和空間上表達的基因組編碼的全部蛋白質及其組成成分、表達水平和修飾狀態，以及蛋白質與蛋白質的相互作用和聯系，從蛋白質水平了解肺鱗癌的發生發展機理，診斷、治療及其預后判斷提供客觀依據，主要包括結構蛋白質組學和功能蛋白質組學研究。目前研究主要集中在前者，標本大多取自活體肺鱗癌組織、體外培養的肺鱗癌細胞和人體血清。肺鱗癌的蛋白質組學研究技術包括蛋白質分離技術、蛋白質鑒定技術和生物信息學技術。蛋白質分離技術常用的有雙向凝膠電泳(twodimensional gel electrophoresis，2-DE)；二維液相色譜(two-dimensional liquid chromatography，2D-LC)、二維毛細管電泳(two-dimensional capillary electrophoresis，2D-CE)、液相色譜—毛細管電泳(liquid chromatographycapillary electrophoresis，LC-CE)等技術，其主流技術是雙向凝膠電泳；蛋白質鑒定技術主要有質譜分析法(mass spectrometry,MS),窄pH梯度膠分離以及高靈敏度蛋白質染色技術，其中質譜分析法包括電噴霧質譜技術(electrospray ionization,ESI)、基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)、表面增強激光解析電離飛行時間質譜(surface-enhanced laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry,SELDI-TOFMS)，生物信息學是由計算機技術、網絡技術和生命科學技術研究發展相互融合而成的一門新學科,主要用于數據的收集、存儲、處理、構建、搜索及研發等[1-2]。就目前來看，國外對于肺鱗癌的蛋白質組學研究進行得較少，我國在這方面的研究處于領先。

2 肺鱗癌發病機制與早期診斷的蛋白質組學研究

2.1 活體組織肺鱗癌的蛋白質組學研究

肺鱗癌的發病機制目前仍不是很清楚，從蛋白質組學研究角度，了解到在肺鱗癌的發生發展過程中有一些新蛋白質的出現，也有一些其它正常組織或癌組織中也存在，但在肺鱗癌組織中呈現顯著增多或減少的蛋白質，這對于了解肺鱗癌的發病機制以及早期診斷肺鱗癌有很大的幫助。

黃英等[3]對肺鱗癌組織Wnt5a蛋白表達的研究表明，在鱗癌組織中Wnt5a蛋白表達明顯升高，Wnt5a蛋白表達與Wnt5a基因有相同趨勢，Ⅲ～Ⅳ期較Ⅰ～Ⅱ期增高，且吸煙患者的Wnt5a蛋白表達也較非吸煙患者為高。羅國安等[4]鑒定出了7個僅在肺鱗癌表達的蛋白，包括zinc finger protein 160、complex Ⅰ、MHC class Ⅰ antigen、KIAA1323 protein、ORF protein、CaMK-Ⅱ、gamma subunit；有如下蛋白表達量在肺鱗癌顯著增多: MPOC, hemoglobin mutant βchain，hemoglobin β chain，MnSOD，Prx-1，DJ-1，CB，similar to v-ets avian erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1，Anti TNF-alpha antibody light-chain Fab fragment (2個) ERp29，CGI-145 protein mRNA，hemoglobinβ-subunit variant，immuno globulin kappachain VK-1，ADP-ribosyl cyclase 1，Ig kappa chain N IG2 precursor，CRT，DJ398G3.1，mutantβ-globin；有如下蛋白呈低表達: serumalbumin，a-enolase -1，BiP protein，PD IA1，TPM2，TPM3， Vim，β-actin，Glx I，similar to hypothetical protein FLJ10830，SNAP，HSP27，neuropolypep tide h3，AK1，aldolase A。

SCC-Ag是腫瘤相關抗原(TA24)提純亞單位，是鱗癌細胞的一種特殊蛋白質，正常組織含量極低[5]。在參與肺鱗癌組研究的患者中陽性率為68.15%，表達水平為3127±2119，表明SCC-Ag可作為肺鱗癌與其它類型肺癌的鑒別診斷指標[6]。

通過對20例人肺鱗癌組織和配對的癌旁正常支氣管上皮組織進行蛋白質組學研究，湯參娥等[7]人找到差異蛋白質點76個，對68個差異蛋白質點進行了肽質量指紋圖分析，鑒定出一些與瘤基因、細胞周期調控、信號轉導等有關的肺鱗癌相關蛋白；研究并發現了肺鱗癌相關蛋白mdm2、c-Jun和表皮生長因子受體(EGFR)在人肺鱗癌組織中高表達，而在正常對照中均表達下調，結論成功鑒定了68個肺鱗癌相關蛋白。

吳曉英等[8]應用脫氧膽酸-三氧醋酸(DOC-TCA)法提純支氣管上皮癌變各階段組織總蛋白質，比較分析人支氣管正常上皮、鱗狀化生、典型增生和上皮浸潤癌組織各7例的雙向凝膠電泳圖譜，鑒定出大量與細胞增生、分化和信號傳導相關的蛋白質，發現其中TPR repeat-protein 1能與熱休克蛋白(hsc70)的c端區域相互作用，抑制某些還原酶的活性；WAP14作為蛋白酶抑制子，它可能是抗擊入侵的微生物或調節內源性蛋白水解酶，可能與鱗化后纖毛的防御能力喪失而機體以此代償有關；Folate receptor2具有調節組織的葉酸平衡及抗腫瘤作用；M-phase phosphoprotein 6對細胞分裂進程有促進作用；hnRNP G與hnRNP B1是同一家族成員，hnRNP B1在不典型增生與早早期肺癌中均過表達；TNF alpha induced protein 1能誘導和抑制多個基因表達，如通過抑制癌基因c-jun表達而發揮抗腫瘤作用。MTAPase參與嘌呤、多苯胺的代謝及與調節轉甲基化的活性有關。在上皮浸潤性鱗癌組織中表達的N-myc-interactor(Nmi)是Mvc蛋白家族的新成員，此蛋白家族在細胞增生、分化和腫瘤轉型方面起著重要作用。在浸潤癌組織中兩種蛋白RGS-R(Regulator of G-protein signaling 16)和Mitogen-activated protein kinase 10(JNK3)均為重要的信號傳導蛋白，其中RGS-R參與EGFR信號傳導通路，P53對此種G蛋白信號調節子具有靶向性抑制作用；JNK3除調節信號傳導外，還是一種與神經凋亡有關的蛋白激酶。該研究為進一步探討肺鱗癌癌變機制，篩選肺鱗癌的特異性分子標志物奠定了初步基礎。

李萃等[9]的另一項研究結果鑒定出一些共同的肺鱗癌相關蛋白質，如原癌基因c-Jun、上游結合因子、鳥嘌呤核苷酸結合蛋白質B亞單位樣蛋白、Rho相關的GTP結合蛋白RhoQ、mdm2、XEDAR等，發現它們在肺鱗癌發病中具有重要的作用，有可能是鱗癌潛在的分子標志物。密歇根大學醫學中心在對16例肺鱗癌研究中發現了52個與其它類型肺癌差異表達的蛋白質點。其中32個蛋白質點已被鑒定。該研究將有利于鑒定肺鱗癌新的早期診斷的分子標志物[10]。

2.2 體外培養肺鱗癌細胞的蛋白質組學研究

體外培養細胞也是用來進行蛋白質組學研究的一種取材，其優點就是細胞純度高，不存在干擾標本檢測的其它組織。但體外培養細胞不足之處在于經過多代培養后，子代細胞可能有蛋白質的變化差異存在，影響研究結果。同時一些分泌蛋白被分泌到細胞外也無法精確測定。

Zhang等[11]選擇人肺鱗癌細胞系NCI-H226進行2-DE分析研究，鑒定出28種肺鱗癌蛋白質,并建立了肺鱗癌NCI-H226細胞系的2D數據庫，該庫由127種蛋白質組成，這是迄今為止最大的肺癌2D蛋白質組數據庫之一，對肺鱗癌及其它類型肺癌的進一步研究提供了重要的線索。詹顯全等[12]對人肺鱗癌細胞系NCI-H 520雙向電泳圖譜中的60個蛋白質點進行PMF分析，初步鑒定了44個與細胞周期、細胞信號傳導有關的蛋白質。Li等[13]運用血清蛋白質組學分析法對人肺鱗癌細胞系HTB-182進行生物標記物篩選，鑒定出16種差異表達的蛋白質。

2.3 血清肺鱗癌蛋白質組學研究

血清的蛋白質組學研究相對于組織的蛋白質組學研究而言，難度要大。主要原因在于血清中蛋白質豐富，干擾大，存在大量高豐度的蛋白質，而所要研究的目標蛋白質在血清中的豐度可能極低，蛋白質分子量極少，難以檢測到，因此血清蛋白質組學研究對儀器設備的要求更高，以前所采用的血清蛋白質組研究方法只能獲得一些豐度高的蛋白質，目前最新的、敏感度較高的血清蛋白質組學研究采用的方法主要為SELDI(Surfaced Enhanced Laser Desorption／Ionization)蛋白質芯片技術。它具有快速、簡單、敏感、樣本用量少等優點[14]。

采用以腫瘤免疫學與蛋白質組學研究技術有機地結合為基礎的血清蛋白質組學研究體系(SERPA),李萃等[15]成功鑒定出14個肺鱗癌相關抗原,利用IPG雙向電泳分離人肺鱗癌組織及癌旁正常支氣管上皮組織的總蛋白質，以識別差異表達的蛋白質；應用質譜儀得到相應的肽質指紋圖譜，鑒定出一些瘤基因、細胞周期調控、信號轉導等有關的蛋白質，包括α-烯醇酶及其異構體、前B細胞增強因子前體、細胞角蛋白10、二硫化物異構酶ER60前體、ATP合酶β鏈、磷酸丙糖異構酶及其異構體、磷酸甘油酸變位酶1、果糖二磷酸醛縮酶、膜聯蛋白A2、鳥嘌呤核苷酸結合蛋白質β亞單位樣蛋白、碳酰還原酶，它們均與肺鱗癌的發生、發展密切相關。

戴嵩瑋等[16]驗證并鑒定出在肺鱗癌病人血清淀粉樣蛋白質SAA高表達，而且隨著病程的惡化，SAA的表達水平升高，CYFRA21-1屬角蛋白19片段，是非小細胞癌較有價值的血清腫瘤標志物[17-18]，通過對鱗癌患者不同臨床分期血清兩種細胞角蛋白分子片段(TPS，CYFRA 21-1)及SCC-Ag的檢測結果比較可以看出鱗癌患者Ⅲ、Ⅳ期血清TPS，CYFRA 21-1及SCC-Ag水平及陽性率明顯高于Ⅰ、Ⅱ期(P＜0.05)，而各期鱗癌患者TPS，CYFRA21-1的檢測陽性率均高于SCC-Ag的檢測陽性率[19]。趙兵等[20]通過用化學發光法檢測發現CYFRA21-1在肺鱗癌中陽性率極高，達84.8%，SCC在肺鱗癌組中陽性率為37%。進一步說明SCC可作為肺鱗癌的鑒別指標，有助于肺癌的病理分型。

聶贛娟等[21]通過對肺鱗癌患者及健康人血清蛋白質組學研究，識別了4條差異蛋白質條帶，鑒定了29種非冗余的蛋白質，其中一些蛋白質可能是候選的肺鱗癌血清分子標志物，該研究發現結合珠蛋白-2(HP-2)在肺鱗癌患者血清中的表達水平高于健康人。

3 肺鱗癌預后判斷的蛋白質組學研究

蛋白質的差異表達也能對肺鱗癌的預后作一定的判斷，即通過檢測某種蛋白質的表達增高或減低，來判斷腫瘤預后的好壞。這方面也取得了一些重要的成就。如羅國安等[4]鑒定出了24個與肺癌發生有關的蛋白，分別是：髓過氧化物酶異構體(C)A鏈、錳過氧化物歧化酶A鏈、Peroxiredoxin 1、人主要組織相容性抗原Ⅰ、組織蛋白酶B、磷酸丙糖異構酶、ADP-ribosyl cylase1、α-烯醇化酶21、β-原肌球蛋白2、Vimentin、β-肌動蛋白、醛酮變位酶Ⅰ、熱休克蛋白27、神經肽h3、凝結因子X、Galectin-1、醛縮酶A、MAP kinase 3b、p53相關蛋白、Cyclophilin A、血清白蛋白、BiP protein和血色素蛋白。從目前對肺癌臨床檢測和疾病愈后來看，Prx-1，CB，α-enolase，ADP-ribosyl cyclase，CRT，TPI，醛縮酶A(aldolase A)，HSP27等可用于肺鱗癌臨床診斷指標，其活性上升預示著有不佳的預后。相反，BiP，Glx Ⅰ，MnSOD，TPM活性上升則預示了良好的預后。在對靶蛋白(酶)的尋找上，MAP激酶3b和GlxⅠ值得關注。張廷平等[22]發現在肺鱗癌中，NK細胞和DCs在腫瘤組織中的浸潤數量與腫瘤患者的預后呈正相關，可作為判斷肺鱗癌預后的指標之一，兩者聯合檢測意義較大，但兩者不是影響預后的獨立因素。Engel等[23]發現肺鱗癌nm23 mRNA的表達高于癌旁正常組織，低分化癌高于中分化癌，nm23 mRNA高表達病例生存時間短。鄒偉等[24]在肺鱗癌研究中還發現，半年內死亡組的p53蛋白陽性表達率明顯高于5年以上生存組；半年內死亡組p16蛋白陽性率則明顯低于5a以上生存組；nm23蛋白表達與患者預后關系不明顯。

4 肺鱗癌蛋白質組學研究的發展前景

蛋白質是基因表達的產物，理論上認為，肺鱗癌細胞發生了多少基因突變，就有多少種肺鱗癌的細胞蛋白質變化。目前對于肺鱗癌蛋白質組學研究其難點仍在于對低豐度蛋白質的提取與鑒定，這主要是對研究設備提出了新的要求。此外，雖然目前在肺鱗癌蛋白質組學研究方面已經鑒定出了不少差異蛋白質，但這些蛋白質相對于肺鱗癌的臨床診斷而言其特異性、敏感性有多大，仍有待我們作進一步的研究。研究肺鱗癌的發病機制關鍵是在于從分子生物學角度進行，隨著研究層次的更加精深發展和研究設備的不斷更新提升，對肺鱗癌的研究也將越來越廣泛。但對于肺鱗癌的總蛋白質的提取仍是一個長期的過程。相信在不久的將來，隨著實驗技術的進步，對于探索肺鱗癌的分子生物學事件及其發病機制必將變得更加清晰。

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The proteome study of lung squamous cell carcinoma (LSCC) is one of the methods to explore the mechanism of LSCC, and can provide much important information for clinical diagnosis、treatment and judging for the prognosis of LSCC. Till now there has much achievementscientific research in this field, here presenting an overview.

lung cancer; squamous cell carcinoma; proteome; diagnosis; prognosis

10.3969/j.issn.1009-4393.2010.12.020

410013 中南大學湘雅三醫院胸外科 (曾劍 金龍玉 劉建新)