菜籽多糖研究進展

朱建飛，嚴奉偉，吳謀成

（1.重慶工商大學環境與生物工程學院，綠色食品研究所，重慶400067；2.長江大學生命科學學院，湖北荊州434025；3.華中農業大學食品科學技術學院，湖北武漢430070）

菜籽多糖研究進展

朱建飛1，嚴奉偉2，吳謀成3

（1.重慶工商大學環境與生物工程學院，綠色食品研究所，重慶400067；2.長江大學生命科學學院，湖北荊州434025；3.華中農業大學食品科學技術學院，湖北武漢430070）

對有關菜籽多糖的國內外研究狀況進行了較全面的綜述，涉及多糖的制備工藝、結構表征及功能活性等方面。

菜籽多糖，制備工藝，結構表征，功能活性

油菜是一種重要的油料作物，我國油菜籽產量居世界第一位。每年油菜籽制油后所產生的菜籽粕達600～700萬t［1-2］。菜籽粕中含有蛋白質、酚類化合物、植酸、多糖等成分，很多研究表明，這些成分都具有較高利用價值［3-7］。本文探討了菜籽多糖的研究進展。

1 菜籽多糖的制備工藝

要想獲得多糖純品，一般都要經過以下步驟：a.預處理，對菜籽預處理以利于提取并增加菜籽多糖的提取得率并且減少提取過程中雜質的混入；b.提取，通過不同方法將菜籽多糖從預處理后的菜籽粕中提取出來；c.分離，采用不同處理手段將大量非多糖類物質除去；d.純化，采用各種不同方法將多糖均一性組分純化出來。

1.1 預處理

首先將菜籽粕進行粉碎處理以利于后續的提取工藝。然后就是對菜籽進行脫脂處理，通常以石油醚、乙醚、乙醇、丙酮等作為脫脂劑，如果是已經過充分榨油處理的脫脂菜籽粕則無需此過程。由于菜籽粕中富含單糖、雙糖、低聚糖、酚類等小分子物質，為了減少提取多糖的過程中這些物質的混入，需要進行去除小分子的前處理。Aspinall等［8］從菜籽殼中提取果膠類多糖時，依次采用石油醚、丙酮、80%乙醇等對菜籽殼進行前處理。Partha等［9］依次用正己烷浸泡48h、丙酮浸泡24h等前處理得到的菜籽粕作為多糖提取的原料。

1.2 菜籽多糖的提取

最初，菜籽粕被當作果膠類物質的提取原料，以CDTA［10］、EDTA［11］、草酸銨［8］等為螯合劑，從菜籽中提取果膠類物質。而對于半纖維素多糖，由于未發現其利用價值，因此相關研究則未受到重視。Aspinall等將提取果膠后的菜籽粕經脫木質素處理，以氫氧化鈉-四硼酸鈉（硼砂）溶液為提取溶劑，得到一種富含木葡聚糖的多糖組分。Siddiqui等［10-13］采用水溶液、NaOH溶液為提取劑，從脫殼菜籽粕中提取了半纖維素多糖。Eriksson等［14］對脫殼菜籽采用熱水浸提，通過一系列工藝，得到水溶性以及水不溶性多糖。Partha等［8］將菜籽粕依次以0.05mol/L HCl溶液、0.05mol/L KOH+0.4%NaBH4溶液、1mol/L KOH+0.4%NaBH4溶液、KOH+0.4%NaBH4溶液得到了一系列的菜籽多糖組分；同時作者也采用經典的β-葡糖基Yariv試劑法，通過特異性結合反應從菜籽粕中分離得到阿拉伯半乳糖蛋白。朱建飛等［15-16］用水按液料比為28∶1（mL/g）在94℃浸提2.9h，一次提取菜籽多糖得率為2.18%，連續提取三次將水溶性多糖提取殆盡。剩余的殘渣料再以5% NaOH溶液作提取劑，按料液比1∶20，60℃提取2h，得到的提取液以4mol/L HCl溶液中和pH至5，得到水溶性多糖WPS和堿溶性多糖APS。

1.3 菜籽多糖的純化

Eriksson等［10］通過DEAE-Sephadex CL-6B離子交換柱（8×1.6cm）層析，以0.05～2.0mol/L的醋酸鹽緩沖液（pH4.8）梯度洗脫，得到純化的果膠類物質。Aspinall等［8］將以草酸銨、EDTA-Na2為螯合劑提取的不同粗果膠，過DEAE-Sephadex A-50離子交換層析柱，以0.2mol/L甲酸鈉溶液作為洗脫液，得到純化的菜籽殼果膠。之后，Aspinall等［17］又將以EDTA-Na2為螯合劑提取的粗果膠，通過三次DEAE -Sephadex A50柱層析，然后加入費林試液進行分級，接著通過滴加0.2mol/L鹽酸溶液，乙醇沉淀，最終得到木葡聚糖純品。Eriksson等［14］采用快速蛋白液相色譜（FRLC）系統，將水溶性菜籽粗多糖過Fractogel TSK HW-75（S）柱，通過折光率（RI）和254nm紫外檢測，經過糖分析收集主峰。收集物通過透析、冷凍干燥，如此反復過柱10次，得到純化多糖。朱建飛等［16，18］將水溶性多糖和堿溶性多糖初提物分別經篩選出的特1號大孔吸附樹脂柱層析、分步醇沉、DE-52纖維素離子交換柱層析等方法純化，分別得到各自的主要級分WPS-1和APS-2，經純度鑒定均為相對均一多糖。

2 菜籽多糖的組成結構表征

對于菜籽多糖的組成分析，早期普遍都是采用乙酰化多糖水解產物進行GC、GC-MS分析，并采用FT-IR對多糖的官能團進行初步鑒定。而對于菜籽多糖結構的研究，主要是Aspinall等和Siddiqui等這兩個課題組采用利用甲基化反應研究菜籽多糖各單糖殘基的連接方式。Siddiqui等［12］研究了一種水溶性菜籽多糖結構。從甲基化數據推出，多糖的平均單元是有25個糖殘基組成，其中有9個非還原末端，包括3個Gal殘基、5個Xyl殘基、1個Guc殘基；支鏈有8個Glc殘基（通過4，6位）；剩余的8個非末端殘基由2個（1→6）-Glc、1個（1→2）-Xyl、5個（1→4）-Glc殘基組成。隨后，Siddiqui等［13］又從菜籽中分離得到了一種酸性的阿拉伯半乳聚糖，包含Ara、Gal、GlcA（摩爾比為1∶1.05∶0.13）。甲基化結果顯示酸性阿拉伯半乳聚糖分子是一個多分支的結構，重復的結構單元是由45個糖殘基組成，具體如下：1個Gal的非還原末端、14個 Ara的非還原末端、3個GalA的非還原末端、13個（1→3，6）-Gal、1個（1→2，5）-Ara、2個（1→3，4，6）-Gal；存在的11個非末端殘基包括2個（1→6）-Gal，4個（1→3）-Gal、5個（1→5）-Ara。Aspinall等（1974）從菜籽殼中提取的果膠，酯化度為83%，包含76%的己糖醛酸（主要是GalA）、2%～3%的Gal、8%～9%的Ara、2%的Xyl、2%～3%的Rha、1%的Fuc。主要的果膠級分水解后，其糖醇乙酸酯GC分析表明存在Rha、Fuc、Ara、Xyl、Gal（摩爾比分別為4∶1∶18∶3.7∶2.1）。Aspinall等［17］研究了從菜籽殼中分離的一種堿溶性多糖的結構，衍生化后通過GC-MS分析，結果表明該多糖由Ara、Fuc、Xyl、Gal和Glc，其摩爾比為2∶8∶25∶13∶52，結果表明，多糖是由許多的木葡聚糖組成，另外一些支鏈上還有一些Fuc、Gal末端殘基。Siddiqui等［10］研究了一種堿溶性菜籽多糖的結構，其單糖組成包括Gal、Glc、Xyl、Guc，摩爾比分別為3∶14∶10∶2。甲基化研究顯示多糖含有高支鏈結構。甲基化分析表明，平均每33個糖殘基中，含有11個非還原末端（8個Xyl、2個Fuc和1個Gal），支鏈中有11～12個（1→4，6）-Glc殘基，余下的8個非末端殘基由2個（1→2）-Xyl、4個（1→4）-Glc和2個（1→2）-Gal組成。

直到90年代中期，核磁共振（NMR）等先進技術才被用于菜籽多糖的結構分析。Eriksson等［14］研究了富含Ara和Gal（Ara/Gal為5.4）的菜籽多糖的結構，通過甲基化分析，以及幾種NMR，包括一維核磁共振分析（1D NMR），如一維核磁共振氫譜（1D1H NMR）、一維核磁共振碳譜（1D13C NMR），二維核磁共振分析（2D NMR），如1H，13C HMQC譜、NOESY譜、1H，1H COSY譜。結果分析表明該多糖主要是一個阿拉伯聚糖組分。含有（1→5）鍵（A）或（1→2）鍵（B）位異頭碳的Ara基團，和（1→5）鍵（D）或（1→2）鍵（C）位異頭碳的2，5位被相鄰Ara基取代的Ara殘基。A、B、C、D摩爾比為2∶1∶1∶1。Partha等［9］采用三甲基硅烷（TMS）衍生化GC法分離鑒定多糖組分，并多糖結構鑒定采用的分析方法包括體積排阻色譜（SEC）、配有脈沖安培檢測器的高效陰離子交換色譜（HPAE-PAD）以及質輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）。作者采用木聚糖內切酶處理多糖組分4OH-M，并對酶處理后的低聚物（命名為M4Xose）進行組成分析，發現有少量的葡萄糖，以及痕量的其他糖類包括4-O-甲基-葡萄糖醛酸（4-O-Me-GlcA）。進一步用HPAE-PAD分析表明，M4Xose含有Xyl（27%）和木二糖（26%）。MALDITOF MS法分析木聚糖酶水解得到的寡聚物，顯示有多種不同的酸性片段存在。根據荷質比推斷出有Xyl4-4-O-Me-GlcA、Xyl5-4-O-Me-GlcA、Xyl6-4-O-Me-GlcA、Xyl7-4-O-Me-GlcA和Xyl6-GlcA。用（1→4）-β-葡萄糖外切酶為木糖葡聚糖降解酶，處理多糖組分4OH-M，產生的低聚糖通過甲基化分析表明，存在末端木糖（T-Xyl）、T-Fuc、T-Gal、（1→2）-Xyl、（1→2）-Gal、（1→6）-Glc和（1→4，6）-Glc殘基。研究結果顯示，脫脂菜籽粕中主要的非纖維素多糖是阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳糖蛋白、鼠李半乳聚糖I和半纖維素聚合物。這是作者首次發現脫脂菜籽粕含有阿拉伯半乳聚糖（一類具有藥理學和食品工業應用價值的植物蛋白多糖）。朱建飛等［16，19］采用糖醇乙酰酯衍生物氣相色譜法（GC）和1-苯基-3 -甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生化高效液相色譜法（HPLC）測定單糖組分，得出菜籽多糖級分WPS-1主要由Ara組成，還含有少量的Gal，Glc等單糖。對比通過甲基化分析以及一維NMR（包括13C NMR和1H NMR）對菜籽多糖級分WPS-1的結構表征進行了研究，得出WPS-1的主體部分主要是由（1→5）鍵和（1→2）鍵連接的Ara殘基組成的多支鏈α-阿拉伯聚糖，同 Eriksson等［14］的研究結果非常相似。

3 菜籽多糖的功能活性研究

在國內，僅本實驗室對菜籽多糖的生物活性進行了初步研究，發現其具有抗氧化、抑瘤等作用。嚴奉偉等［20］研究菜籽多糖粗品的抗氧化作用與機理。用K3［Fe（CN）6］與TCA體系、脂肪氧合酶評價菜籽多糖的還原能力及抑制脂肪氧合酶的能力，用丙二醛（MDA）及活性氧（ROS）試劑盒測定MDA及ROS含量，用分光光度法測定小鼠肝線粒體腫脹度。結果顯示，在化學模擬體系中，菜籽多糖具有還原能力，2.00mg·mL-1菜籽多糖的抗活性氧單位為94.03，對脂肪氧合酶的抑制率達 22.8%。在體外，2.00mg·mL-1菜籽多糖使自由基誘導的小鼠肝線粒體腫脹度低于非誘導組，對自由基誘導的小鼠肝線粒體MDA生成抑制率達30.3%，對肝組織勻漿MDA生成抑制率分別為54.7%（非誘導組）、32.0%（Fe2+誘導組）及84.5%（H2O2誘導組）。10.00mg·mL-1菜籽多糖使小鼠血清抗活性氧單位達1340.13。在體內，腹膜注射菜籽多糖組小鼠（400mg·mL-1bw·d-1，12d）與對照組相比，肝勻漿MDA的降低達到極顯著水平（P＜0.01）。結果表明，菜籽多糖在體內外均具有明顯的抗氧化作用，菜籽多糖具有還原能力及抑制與氧化有關的酶的活性可能是其抗氧化的機理。

嚴奉偉等［21］研究了菜籽多糖的抑瘤作用及其機理。通過接種S180細胞復制荷S180瘤小鼠模型，分別腹膜注射生理鹽水、環磷酰胺、菜籽多糖，測定各組小鼠腫瘤重量與臟器指數、免疫能力、抗氧化能力、乳酸脫氫酶活力等指標。結果表明，50～200mg/kg·d的RSPS抑瘤率在20.66%～34.710%之間；RSPS能顯著提高荷瘤小鼠脾臟指數、腹腔巨噬細胞吞噬率與吞噬指數、遲發性超敏反應、小鼠血清溶血素含量與脾細胞抗體形成等指標，顯著抑制荷S180小鼠血清LDH的活性，提高紅細胞CAT活性，降低血清溶血素MDA含量。以上結果表明，RSPS在小鼠體內具有抑制S180肉瘤的作用，能增進荷瘤小鼠免疫力、清除自由基與抑制LDH活性可能是其抑制腫瘤的機理。

嚴奉偉等（2007）研究菜籽多糖（RSPS）在四氧嘧啶致糖尿病小鼠體內的降血糖作用。發現菜籽多糖能顯著降低糖尿病小鼠血糖水平，增加糖尿病小鼠胸腺與脾臟指數，提高血清抗活性氧單位，降低肝勻漿MDA含量。

朱建飛等［16，19］系統研究了菜籽多糖的體外活性。分別采用鄰苯三酚-魯米諾、硫酸銅-鄰菲啰啉-抗壞血酸-雙氧水、魯米諾-雙氧水三種化學發光體系，通過微弱發光測量儀測定了菜籽多糖WPS-1和APS-2對超氧陰離子（·）、羥基自由基（·OH）和雙氧水（H2O2）三種ROS的體外清除作用。結果表明，WPS-1和APS-2對各ROS都有良好的體外清除作用，且都呈劑量-效果關系。WPS-1和APS-2在實驗最高濃度2000μg/mL時，對·的極大抑制率分別為90.4%和89.6%。WPS-1和APS-2對·的半數抑制濃度（IC50）分別為400±44μg/mL和450 ±64μg/mL。WPS-1比APS-2具有更好的清除·能力。WPS-1和APS-2在實驗最高濃度1000μg/mL時，其對·OH的極大抑制率分別為 93.8%和86.7%。WPS-1和APS-2對·OH的IC50分別為240 ±18μg/mL和293±24μg/mL。WPS-1比APS-2具有更好的清除·OH的能力。WPS-1和APS-2在實驗最高濃度50μg/mL時，其對H2O2的極大抑制率分別為84.2%和85.2%。WPS-1和APS-2對H2O2的IC50分別為 10.0±0.8μg/mL和 6.1±0.5μg/mL。APS-2清除H2O2的能力略強于WPS-1。比較IC50值，WPS-1和APS-2對各自由基的清除能力都表現為：H2O2＞·OH＞O-2·。

朱建飛等［19］采用尼龍毛柱法從脾淋巴細胞分離T、B淋巴細胞。通過MTT法檢測，發現菜籽多糖對總脾淋巴細胞和T淋巴細胞具有明顯的增殖活性，并表現出明顯的劑量-效果關系，增殖的最佳濃度為40μg/mL，并且WPS-1比APS-2作用效果更好。采用半定量RT-PCR進一步研究菜籽多糖WPS-1對T淋巴細胞分泌的細胞因子白細胞介素2（IL-2）、IL-4、IL-6、干擾素γ（IFN-γ）mRNA表達的影響。首先研究了各細胞因子mRNA隨WPS-1作用時間的變化，WPS-1促進IL-2、IL-4、IL-6 mRNA表達最佳作用時間都為24h，而促進IFN-γ mRNA表達的最佳作用時間為12h。采用各細胞因子mRNA表達的最佳作用時間，進一步考察WPS-1濃度的影響，得到其對促進IL-2、IL-6、IFN-γ mRNA表達的最佳濃度都為40μg/mL，而對IL-4則為20μg/mL。菜籽多糖可能對淋巴細胞的免疫功能具有調節作用。

朱建飛等［19］采用MTT法檢測細胞的活性，發現菜籽多糖能促進巨噬細胞增殖，并表現出明顯的劑量-效果關系，菜籽多糖促進巨噬細胞增殖的最佳濃度為40μg/mL，WPS-1比APS-2對巨噬細胞增殖活性的促進作用略大。菜籽多糖對巨噬細胞的影響與對T淋巴細胞的檢測結果相類似。采用半定量RT-PCR進一步研究不同作用時間下40μg/mL菜籽多糖WPS-1對腹腔巨噬細胞IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）這兩種細胞因子以及誘生型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA表達的影響。WPS-1對腹腔巨噬細胞IL-6、TNF-α和iNOS mRNA的表達量最大的時間為24h。菜籽多糖可能對巨噬細胞的免疫功能具有調節作用。

4 展望

菜籽多糖作為菜籽粕綜合利用研究中發現的具有開發利用價值的又一種生物活性物質，國內對于菜籽多糖的研究起步較晚，近幾年才從本實驗室開始。對其生產工藝、結構鑒定和生物活性已有初步探討，但還有待于進一步深入研究，為菜籽多糖的應用奠定基礎。

［1］吳謀成，袁俊華.加快我國油菜籽加工及綜合利用的研究與產業化［J］.糧食與油脂，2001（1）：11-13.

［2］王漢中.我國油菜產需形勢分析及產業發展對策［J］.中國油料作物學報，2007，29（1）：101-105.

［3］Pastuszewska B，Jablecki G，Buraczewska L，et al，The protein value of differently processed rapeseed solvent meal and cake assessed by in vitro methods and in tests with rats［J］.Anim Feed Sci Technol，2003，106：175-188.

［4］El-Batal A I，Abdel K H.Phytase production and phytic acid reduction in rapeseed meal by Aspergillus niger during solid state fermentation［J］.Food Research International，2001，34：715-720.

［5］Xu L，Diosady L L.Rapid method for total phendic acid determination in rapeseed/canola meals［J］.Food Res Int，1997，31：571-574；Villeneuve，2005.

［6］Villeneuve P，Turon F，Caro Y，et al.Lipase-catalyzed synthesis of canola phytosterols oleate esters as cholesterol lowering agents［J］.Enzyme Microb Tech，2005，37：150-155.

［7］嚴奉偉，羅祖友，吳季勤.菜籽多糖的抗氧化作用與機理研究［J］.中國農業科學，2005，38（1）：157-162.

［8］Aspinall G O，Jiang K S.Rapeseed hull pectin［J］.Carbohyd Res，1974，38：247-255.

［9］ParthaG，ProdyotG，Swapnadip T，etal.Cellwall polysaccharides of Brassica campestris seed cake：isolation and structural features［J］.Carbohyd Polym，2004，57：7-13.

［10］Siddiqui I R，Wood P J.Structural Investigation of watersoluble rapeseed（Brassica campestris）polysaccharides（Part V）［J］.Carbohyd Res，1977，53：85-94.

［11］Eriksson I，Andersson R，?man P.Extraction of pectic subtances from dehulled rapeseed［J］.Carbohyd Res，1997，301：177-185.

［12］Siddiqui I R，Wood P J.Structural Investigation of watersoluble，rapeseed（Brassica campestris）polysaccharides（Part I）［J］.Carbohyd Res，1971，17：97-108.

［13］Siddiqui I R，Wood P J.Structural Investigation of watersoluble，rapeseed（Brassica campestris）polysaccharides（Part II）［J］.Carbohyd Res，1972，24：1-9.

［14］Eriksson I，Andersson R，Westerlund E，et al.Structural features of an arabinan fragment isolated from the water-soluble fraction of dehulled rapeseed［J］.Carbohydr Res，1996，281：161-172.

［15］朱建飛，吳謀成，馮睿，等.菜籽粕中水溶性多糖提取工藝優化［J］.農業工程學報，2006，22（12）：251-254.

［16］Zhu J F，Wu M C.Characterization and free radical scavenging activity of rapeseed meal polysaccharides WPS-1 and APS-2［J］.J Agr Food Chem，2009，57：812-819.

［17］ AspinallG O，Krishnamurthy T N，RosellK.A flucogalactoxyloglucan from rapeseed hulls［J］.Carbohyd Res，1977，55：11-19.

［18］朱建飛，嚴奉偉，吳謀成.大孔吸附樹脂初步純化菜籽粕中水溶性多糖［J］.中國糧油學報，2007，22（6）：104-108.

［19］朱建飛.菜籽多糖的制備、表征及體外活性［D］.武漢：華中農業大學博士學位論文，2008.

［20］嚴奉偉，羅祖友，吳季勤.菜籽多糖的抗氧化作用與機理研究［J］.中國農業科學，2005，38（1）：157-162.

［21］嚴奉偉，王辰，嚴贊開.菜籽多糖對S180小鼠肉瘤及其免疫能力的影響［J］.食品科學，2007，28（4）：309-313.

Research progress in rapeseed polysaccharides

ZHU Jian-fei1，YAN Feng-wei2，WU Mou-cheng3
（1.College of Environmental and Biological Engineering，Natural and Health Food Research Institute，Chongqing Technology and Business University，Chongqing 400067，China；2.College of Life Science，Changjiang University，Jingzhou 434025，China；3.College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）

The study on rapeseed polysaccharides at home and abroad were discussed comprehensively，including the preparation technology，structural characterization and bioactive activity of rapeseed polysaccharides.

rapeseed polysaccharides；preparation technology；structural characterization；bioactive activity

TS201.2+3

A

1002-0306（2010）12-0366-04

2009-11-13

朱建飛（1979-），男，講師，博士，研究方向：農業資源綜合利用。

國家“十五”重大科技專項資助項目（2001BA501A20）。