氟中毒大鼠成骨細胞激活與bFGF、c-fos/c-jun表達研究

趙 軍,張文嵐*,張 偉,李廣生

(吉林大學第一醫院1.器官移植中心,泌尿外二科;2.骨科,吉林 長春 130021;3.吉林大學再生醫學研究所)

氟中毒大鼠成骨細胞激活與bFGF、c-fos/c-jun表達研究

趙 軍1,張文嵐1*,張 偉2,李廣生3

(吉林大學第一醫院1.器官移植中心,泌尿外二科;2.骨科,吉林 長春 130021;3.吉林大學再生醫學研究所)

目的 探討氟中毒大鼠激活的成骨細胞系中bFGF、c-fos、c-jun的差異表達。方法應用飲水加入氟化鈉進行大鼠染氟實驗,采用原位雜交技術、Western blot技術、免疫組織化學方法,對氟中毒大鼠骨組織進行增殖刺激因子bFGF、c-fos、c-jun的差異表達的定量分析。結果實驗表明無論是在高鈣飼養還是在低鈣飼養,過量攝入NaF可刺激慢性氟中毒大鼠椎骨各包被成骨細胞增殖,并誘導bFGF過表達,與對照組相比差異顯著(P＜0.001);c-fos、c-jun表達明顯高于對照組,差異顯著(P＜0.001、P＜0.05);相關分析顯示bFGF過表達與 c-fos、c-jun的蛋白質水平呈正相關。結論過量氟可以刺激大鼠成骨細胞系激活、增殖能力增強、bFGF、c-fos、c-jun表達增強,提示bFGF可能通過上調 cfos、c-jun的表達而參與成骨細胞的增殖和分化。

大鼠氟中毒;成骨細胞激活;bFGF;c-fos/c-jun

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1183)

氟化物通過促進成骨細胞系DNA合成增加,直接刺激成骨細胞系細胞增殖、增強堿性磷酸酶含量和活性,使骨鈣素(ostelcalcin)增高、膠原合成增加而發揮對骨的特征性作用,其對成骨細胞的促增殖作用的分子調控機制尚不十分清楚。研究顯示,在慢性氟中毒的成骨細胞激活狀態伴有多種基因表達上調,參與成骨細胞的增殖和分化調節[1,2]。但是氟化物對大鼠增殖的成骨細胞堿性成纖維細胞生長因子bFGF(basic fibroblastgrowth factor,bFGF)的表達及其與原癌基因c-fos、c-jun在氟骨癥中的表達的相互關系目前尚不清楚。我們采用飲水加氟進行大鼠染毒實驗,觀察不同飼養條件、不同濃度氟化鈉(Sodium Fluoride,即:NaF)對染氟后大鼠成骨細胞系激活狀態bFGF、c-fos和c-jun的表達水平并進行相關分析,據此探討慢性氟中毒骨相損害相關的基因調節的分子基礎。

1 材料與方法

1.1 動物分組與處理

實驗動物系白求恩醫科大學實驗動物部提供的封閉群動物Wistar大鼠72只,雌雄各半,體重120g左右。隨機分為高鈣和低鈣兩大組。高鈣大組又分為高鈣加氟組(飲水加F-100mg/L)和高鈣對照組,每組24只;低鈣大組又分為低鈣加氟組(低鈣飼料飲水加F-50 mg/L)和低鈣對照組,每組12只。高鈣組用白求恩醫科大學實驗動物部提供的富鈣平衡飼料;低鈣組用自制低鈣飼料喂養,飲水采用長春自來水,其含氟量忽略不計。含氟(F-)水的配制:100mg F-/L含氟(F-)水每升水投分析純氟化鈉221.0mg。實驗期間動物自由攝食、進水,實驗周期20周[1]。

1.2 試劑

兔抗大鼠bFGF、c-fos、c-jun多克隆抗體購自Santa Cruz Bitechnology公司。

1.3 檢測指標及方法

取慢性氟中毒大鼠脊椎骨4%多聚甲醛固定,薄切3-4μm。HE染色、應用免疫組織化學法檢測檢測成骨活動的骨內膜包被、皮質骨內包被(哈佛管包被)和骨小梁包被的成骨細胞系bFGF、c-fos、c-jun的差異表達。取液氮快速冷凍、-80℃保存的骨外膜包被組織,采用改良Western blot法檢測bFGF、cfos、c-jun蛋白質表達。應用圖像分析儀(HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統)對實驗結果進行吸光度值測定、定量分析。實驗數據采用SPSS 11.0統計軟件進行方差分析和 q檢驗和相關性(Pearson Correlation)分析。

2 結果

2.1 成骨細胞系激活與增殖活躍

本實驗側重觀察大鼠腰椎的改變。椎骨在解剖學上屬于不規則骨,即軟骨內成骨的骨骼。加氟后大鼠骨病變為以成骨功能活躍為主的骨轉換加速,伴破骨性骨吸收增強改變,且以低鈣加氟組病變比較明顯。主要表現為:骨外膜內層(即骨外膜包被)細胞增生活躍,細胞層數增多(圖1);連續骨板的表面以及骨小梁表面可見骨樣組織增多和小梁周圍纖維化(圖2)。長骨(脛骨)可見破骨細胞增多、骨吸收增強和骨干部密質骨松質化(圖3),而在脊椎骨則表現很輕微。在脊椎僅見骨小梁周圍纖維化,而在長骨則骨髓纖維化很明顯(圖4)。

圖1 低鈣+F-(50mg/L)(HE 200×)

圖2 低鈣+F-(50mg/L)(HE 200×)

圖3 低鈣+F-(50mg/L)(HE 200×)

圖4 低鈣+F-(50mg/L)(HE 200×)

2.2 bFGF在成骨細胞的表達

應用免疫組織化學方法在氟中毒大鼠脊椎骨骨小梁表面成骨細胞、骨內膜成骨細胞bFGF陽性表達,位于成骨細胞胞漿和胞核(圖5)。圖象分析顯示,偏食低鈣組大鼠與對照組相比差異顯著(P＜0.01,見表1)。并且,在骨外膜檢測到bFGF蛋白,采用改良Western blot法[7]檢測證明,在骨外膜成骨系細胞bFGF為兩條分別為16 KD和17 KD的陽性蛋白帶(圖6)。氟中毒大鼠骨外膜成骨系細胞bFGF蛋白表達明顯高于對照組(P＜0.01),有顯著意義(見表1)。

表1 大鼠成骨細胞bFGF蛋白表達(吸光度值 ±s)

表1 大鼠成骨細胞bFGF蛋白表達(吸光度值 ±s)

注:與各自對照組相比,**P＜0.01

組別 鼠數 免疫組化 Western blot高鈣對照 6 156.15±4.94 131.03±1.73高鈣加氟 6 142.40±13.95 120.76±1.62低鈣對照 5 158.33±3.58 130.18±2.76低鈣加氟 7 141.80±4.11** 116.24±6.61**

2.3 c-fos、c-jun在成骨細胞系的表達

應用免疫組織化學方法在氟中毒大鼠脊椎骨骨小梁表面成骨細胞、骨內膜成骨細胞c-fos/c-jun陽性表達,位于成骨細胞胞漿和胞核(圖7、8),Western blot法,檢測到骨外膜組織c-fos(62kD)和 c-jun(39 kD)蛋白的陽性雜交帶,統計分析證明c-fos、c-jun基因產物在氟中毒大鼠成骨細胞系均明顯高于對照組,差異顯著(P＜0.05或P＜0.001,見表2、3)。

表2 免疫組化氟中毒大鼠成骨細胞c-fos和 c-jun蛋白質水平(吸光度值 ±S)

表2 免疫組化氟中毒大鼠成骨細胞c-fos和 c-jun蛋白質水平(吸光度值 ±S)

與各自對照組比較,*P＜0.05;**P≤0.001

組別 鼠數 c-fos c-jun高鈣對照 6 152.93±6.15 155.33±3.99高鈣加氟 6 140.73±13.57* 134.03±7.87**低鈣對照 5 149.98±8.31 149.19±11.97低鈣加氟 7 132.46±2.59** 129.79±14.91**

表3 骨外膜成骨系細胞c-fos/c-jun蛋白質水平(吸光度值 ±S)

表3 骨外膜成骨系細胞c-fos/c-jun蛋白質水平(吸光度值 ±S)

注:與各自對照組比較,*P＜0.05;**P≤0.001

組別 鼠數 c-fos 鼠數 c-jun高鈣對照 4 130.48±3.09 6 127.70±2.56高鈣加氟 5 123.32±4.29 6 116.60±8.04**低鈣對照 5 127.98±3.10 5 126.32±5.10低鈣加氟 6 115.97±7.19* 7 108.30±7.34*

2.4 bFGF表達與c-fos、c-jun的關系

采用SPSS統計軟件之Pearson correlation法對骨外膜成骨系細胞bFGF蛋白質表達和c-fos蛋白質水平進行相關分析,結果顯示兩者在蛋白質表達水平呈正相關(r=0.543),有顯著相關性(P＜0.05);同樣,骨外膜成骨系細胞bFGF蛋白質表達和c-jun蛋白質水平相關分析顯示,兩者在蛋白質表達水平呈正相關(r=0.728,P＜0.01)。bFGF和其他多肽類生長因子都具備上調原癌基因表達的作用,在氟化物作用下,bFGF可能通過上調c-fos基因表達水平而參與成骨細胞增殖調節。

圖5 bFGF在氟中毒大鼠成骨細胞系的表達(DAB顯色×200)

圖6 Westren b lot檢測骨 外膜bFGF表達

圖7 c-fos在氟中毒大鼠成骨細胞系的表達(DAB顯色×200)

圖8 c-jun在氟中毒大鼠成骨細胞系的表達(DAB顯色×200)

3 討論

3.1 慢性氟中毒成骨細胞功能活躍

慢性氟中毒的骨骼病變復雜多樣,成骨細胞功能活躍是一個發生較早并起主導作用的環節[3]。氟增加骨形成是通過促進成骨細胞增殖、增加類骨質沉積而實現的。氟在不同種屬動物和人類有促進成骨細胞有絲分裂的作用。在本研究結果中觀察到氟中毒狀態下成骨細胞處于激活狀態。在慢性氟中毒大鼠脊椎的各包被中,均可見成骨細胞系的增殖活躍和成骨細胞的胞體肥大、排列密集[1]。表明過量氟作用下成骨細胞激活是慢性氟中毒氟骨癥發生的重要原因。

3.2 FGF與成骨細胞增殖分化調節

FGF超家族為正常骨骼發育所必需,骨細胞可合成酸性(a-)和堿性(b-)FGF,這兩種形式在骨細胞生長中起重要作用。FGF受體點突變可以引起軟骨發育不全、Grouzon骨病等。aFGF和bFGF都能促進骨細胞的分裂增殖,bFGF還影響骨細胞的表型,增加骨細胞BGP含量、抑制成骨細胞和骨髓干細胞凋亡,具有促進骨形成作用[4-6]。也能抑制ALP活性和減少膠原的合成,bFGF因其含量高,在骨代謝中起更重要的作用。bFGF可由成骨細胞自身合成表達,以自分泌和旁分泌方式起作用,或于骨基質中延遲發揮作用[7,8]。FGF可以促進骨細胞成活,抑制骨細胞凋亡。協同促進骨橋蛋白表達(osteopontin),誘導堿性磷酸酶,形成細胞外基質(ECM)的反饋調節,控制成骨細胞增殖及成骨活動的有機調節[9]。動物實驗中,FGF不僅可以阻止由雌激素水平降低引起的骨丟失,還可以使稀疏、排列紊亂的骨小梁更加豐實、有序;也能增加骨的吸收并誘導成骨細胞合成間質膠原酶,體外抑制膠原的降解和OA患者軟骨組織中軟骨細胞分化,與前列腺素E2協同作用防止骨關節炎(osteoarthritis,OA)患者的膠原蛋白退化[10]。新近的研究表明bFGF具有明顯的調節骨細胞增殖和礦化過程增強骨形成[4,5]。FGF成員在氟骨癥病理過程中表達如何,目前尚少見報道。本研究發現在氟中毒大鼠脊椎骨成骨細胞及骨外膜成骨系細胞有bFGF蛋白呈過表達,與對照組相比差異明顯。說明過量氟化物激活成骨細胞的過程中有bFGF參與。我們還發現bFGF蛋白表達與c-fos、c-jun的蛋白質水平呈正相關,提示bFGF可能通過上調c-fos、c-jun的表達而參與成骨細胞的增殖和分化。在小鼠轉入人金屬硫蛋白啟動子(metallothionein promoter,MT),出現 c-fos基因過表達后,出現干骺端膨大、骨髓纖維化和明顯的新骨形成等一系列骨病變[11]在某種程度上與氟骨癥的骨相改變有很大的相似之處[1]。在過量氟作用條件下c-fos基因活化引起的骨相改變與在成骨細胞bFGF基因活化且過表達呈正相關關系。

氟骨癥的骨相損害是在F-的絲裂原作用下發生的由多種調節因子參與介導的骨轉換異常的復合損傷過程,其發生機制涉及的信號傳導與增殖調節的不同環節,成骨細胞功能活躍是氟骨癥發病的重要環節,本研究發現bFGF不僅在氟中毒大鼠骨內膜、骨小梁表面的成骨細胞有過表達,而且在骨外膜成骨系細胞有明顯過表達,提示在氟化物作用下,成骨細胞激活過程確有bFGF表達增強參與刺激成骨細胞增殖分化調節。有關bFGF基因參與調節的確切機制尚需進一步研究。

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To study the expression of osteoblasts activation and bFGF,c-fos/c-jun in fluorosis rat

ZHAO Jun,ZHANGWen-lan,ZHANG Wei,etal.(Departmentof Transplant Center and Second Urology,The First Hospitalof Jilin University,Changchun130021,China)

ObjectiveTo study the differenceexpression of bFGF,c-fos,c-jun in activation osteoblastsof fluorosis rat.MethodsRat flurosismodelwasmadeby driking waterwith fluroride sodium(NaF),the differenceexpression ofbFGF,c-fos,c-jun in activation osteoblastswere analyzed quantitatively by hybridization in situ,Westernblotand immunohistochemistrymethods.ResultsNaF could stimulate the proliferation of periostealenvelop osteoblast in ratwith flurosiswhether highor low caicium group,induced the over expression of bFGF and wereobvious statistic significance compared with control group(P＜0.001).The expression of c-fos/c-jun werehigher and obvious statistic significance compared with control group(P＜0.001,P＜0.05).The analysis show that theexpression ofbFGF is rational correlationwith the protein expression of c-fos,c-jun.ConclusionExcessive fluoride could stimulate the activation of ratosteob last,increase the proliferation and increase the exp ression of bFGF,c-fos,c-jun.It suggested thatbFGFmaybe take part in the proliferation differation through increasing the expression of c-fos,c-jun.

Fluorosis rat;Osteob lasts activation;bFGF;c-fos/c-jun

R992

A

1007-4287(2010)08-1183-04

國家自然科學基金重點項目(39730390)

*通訊作者

趙軍(1964-),女,醫學碩士,主治醫師,講師,主要從事免疫學分子生物學研究。

2009-10-13)