志賀菌耐多藥相關基因水平轉移的驗證及其耐藥性研究*

王淑玲,宋春花,段廣才,張衛東,郗園林,朱靜媛

志賀菌耐多藥相關基因水平轉移的驗證及其耐藥性研究*

王淑玲,宋春花,段廣才,張衛東,郗園林,朱靜媛

目的對志賀菌耐多藥相關基因(T1C4)水平轉移進行驗證,并對其與細菌耐藥性的關系進行初步判定。方法培養已篩選出的包含T1C4基因片段的陽性克隆,提取其質粒,PCR擴增T1C4基因片段、純化、制備探針,與志賀菌敏感株SS23、志賀菌耐多藥轉移株(ST11)、大腸埃希菌耐多藥株(E667)的基因組DNA和質粒DNA進行斑點雜交。采用藥敏紙片法研究含T1C4基因片段大腸埃希菌的耐藥性。結果應用PCR方法可以從ST11和E667菌株基因組DNA中擴增出T1C4基因片段,而SS23菌株不含該基因片段;應用T1C4基因探針進行斑點雜交顯示,ST11和E667菌株的全基因組和質粒DNA均可顯示雜交信號,而SS23菌株的基因組和質粒DNA均不產生雜交信號;14種藥物的藥敏試驗表明,含有T1C4基因的大腸埃希菌(DH5α)對四環素、先鋒V、頭孢噻吩、氟哌酸、復方新諾明等五種藥物的抑菌環直徑明顯小于(相差 3mm以上)不含T1C4基因的DH5α菌株。結論T1C4基因片段為ST11菌株從E667菌株獲得,且存在于兩菌株的質粒上;T1C4基因可能介導細菌對多種藥物的抗性。

志賀菌;耐多藥;基因水平轉移

細菌可通過自身基因突變和耐藥基因的獲得2種途徑產生耐藥性〔1〕,并且外源性耐藥基因的獲得,即耐藥基因的水平轉移,是臨床耐藥菌株產生的主要途徑之一〔2〕。為了系統研究耐藥基因的水平轉移,本課題組利用臨床分離的大腸埃希菌耐多藥株(E667)作為供體菌,志賀菌敏感株(以下簡稱敏感株或SS23)作為受體菌,經實驗室液體接合試驗,成功獲得了一株志賀菌耐多藥轉移株(以下簡稱轉移株或ST11);通過敏感株和轉移株基因組DNA抑制性消減雜交文庫的構建以及篩選和鑒定,獲得了多個可能與耐多藥相關的基因片段〔3〕。本文對已篩選出的一個未知功能的基因片段(T1C4)在基因組上的位置進行確定,并對其與細菌耐藥性的關系進行初步研究。結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集河南省鄭州市鄭州大學附屬醫院腹瀉患者糞便培養細菌標本,在就診醫院鑒定后,送本實驗室重新進行生化和血清學鑒定。然后對收集的臨床分離志賀菌及大腸埃希菌進行篩選,用頭孢噻吩、諾氟沙星、慶大霉素、磺胺甲基異惡唑四種抗生素采用Kirby-Bauer紙片瓊脂擴散法進行藥敏試驗。大腸埃希菌耐多藥株(E667):對上述四種抗生素均耐藥,分離自鄭州大學一附院;志賀菌敏感株(SS23):對上述四種抗生素均敏感,分離自鄭州大學三附院;志賀菌耐多藥轉移株(ST11):由E667作為供體菌,SS23作為受體菌進行液體接合試驗,在上述四種抗生素選擇壓力下獲得〔3〕。

1.2 試劑 細菌基因組DNA提取試劑盒及瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京天根試劑公司),DNA標記檢測試劑盒(德國ROCHE公司),限制性內切酶HinfI(日本TAKARA生物公司),PCR相關試劑(北京天根生物公司),MH培養基(北京陸橋技術公司),14種抗生素紙片:先鋒V(Cefazolin)、頭孢噻吩(Cefalotin)、先鋒噻肟(Claforan)、慶大霉素(Gentamycin)、鏈霉素(Streptomycin)、妥布霉素(Tobramycin)、四環素(Tetrocycline)、環丙沙星(Ciprofloxacin)、左氧氟沙星(Levofloxacin)、諾氟沙星(氟哌酸)(Norfloxacin)、奈啶酸(Nalidixic acid)、氯霉素(Chloramphenicol)、復方新諾明(SMZ-TMP)、呋喃妥因(Nitrofurantoin)產自杭州天和微生物試劑公司。

1.3 引物 引物由北京賽百勝生物公司合成,第一輪PCR引物為巢式PCR的外側引物:N1:5′-TCG AGC GGC CGC CCG GGC AGGT-3′和 N2R:5′-AGC GTG GTC GCG GCC GAG GT-3′,擴增產物是T1C4基因片段。第二輪PCR所用引物根據本實驗室已經測得的T1C4序列,利用PRIMER 5.0軟件自行設計;P1∶5′-GGG CAG GTA CAC NNN NNN AAA CAC T-3′;P2:5′-GCATCT GCT NNN NNN TGG T TT G-3′;其擴增產物為 T1C4的中間序列。

1.4 方法

1.4.1 質粒DNA及全基因組DNA提取 菌株培養根據參考文獻進行〔4〕;采用堿裂解小量提取質粒DNA法獲得菌株質粒DNA,具體步驟按照分子克隆第3版進行〔5〕;細菌全基因組DNA的提取利用細菌基因組DNA提取試劑盒完成。提取后的質粒DNA(基因組 DNA)各取 3μ L,用 1%瓊脂糖凝膠5V/cm電壓電泳35min,0.5μ g/mL溴化乙錠染色,紫外燈下觀察結果。核酸相對分子質量標準為DL2000 DNA Marker。

1.4.2 聚合酶鏈反應(PCR) 第一輪 PCR在25μ L體系中進行,反應體系參照文獻混合〔6〕。反應條件:94℃預變性5 min,PCR循環參數參照文獻〔7〕完成。

第二輪PCR在50μ L體系中進行,模板為第一輪PCR產物,反應體系詳見參考文獻〔8〕。反應條件94℃預變性5 min,PCR循環參數為:94℃30s,61℃30s,72℃60s,共32個循環,最后 72℃延伸10min。各取第一輪和第二輪PCR產物5μ L,用1.5%瓊脂糖5V/cm電壓電泳30min,0.5μ g/mL溴化乙錠染色,紫外燈下觀察結果。核酸相對分子質量標準為DL2000 DNA Marker。

1.4.3Hinf I酶切鑒定陽性克隆 對第二輪PCR產物Hinf I內切酶酶切鑒定。具體操作過程按照文獻〔9〕和內切酶Hinf I說明書完成。

1.4.4 探針標記與斑點雜交 將第二輪PCR擴增的基因產物利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化后(具體步驟根據該試劑盒說明書完成),采用隨機引物法地高辛標記作為T1C4基因片段的探針。檢測探針的標記效率〔10〕,根據標記的效率選擇合適的探針濃度。取菌株 E667、SS23、ST11的質粒和基因組DNA各2μ L,100℃變性 10min,迅速置冰中5min,將變性后的DNA點在尼龍膜上,在含有探針的雜交液中雜交,應用地高辛試劑盒檢測雜交結果。具體操作步驟根據文獻〔10-11〕完成。

1.4.5 藥敏試驗 采用WHO推薦的改良Kirby-Bauer紙片,其結果判定參照衛生部制定的《紙片法抗菌藥物敏感試驗標準》(WS/T125-1999),質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922株(購自中國藥品生物制品檢定所)。為保證結果的可靠性,每個菌株對同一種抗生素的耐藥性實驗在相同條件下重復兩次。

2 結 果

2.1 PCR擴增及產物的瓊脂糖電泳 分別以E667、SS23、ST11基因組 DNA 為模板,應用N1和N2R引物進行第一輪PCR擴增,結果E667、ST11均可擴增出T1C4基因片段全序列,長度805bp(見圖1-A),而SS23擴增不出這一片段。分別以上述擴增出的DNA片段為模板,應用P1和P2引物進行第二輪PCR擴增,均可產生長度671bp的片段(見圖1-B),與預期結果一致。

圖1 PCR擴增產物的電泳結果Fig.1 PCR amplified analysis of gene T1C4

2.2 PCR產物的酶切檢定 根據已知序列分析,第二輪PCR擴增產物經Hinf I酶切后,應產生281bp和390bp兩條片段,電泳結果與預期一致(見圖2)。

圖2 第二輪PCR擴增產物的Hinf I酶切電泳M:DL 2000 DNA marker;Q:酶切產物;W:第二輪PCR擴增產物Fig.2 Analysis of the 2ndPCR amplified products digestedwith Hinf IM,DL 2000 DNA marker;Q:2ndPCR amplified products digested with Hinf I;W:2ndPCR amplified products

2.3 T1C4探針與待檢測DNA斑點雜交 應用已標記的T1C4基因探針分別與 E667、SS23、ST11的基因組DNA和質粒 DNA進行雜交,結果E667、ST11的基因組DNA和質粒DNA均可產生雜交信號,而與SS23的基因組DNA和質粒均沒有雜交信號,見圖 3。這一結果說明E667和ST11均含有T1C4,且這一基因片段位于兩菌株的質粒上。

2.4 細菌藥敏試驗 應用14種抗生素對大腸埃希菌 DH5α、DH5α(pUC18)、DH5α(pUC18-T1C4)菌株進行藥敏試驗,結果見表 1。從表1可以看出,DH5α(pUC18-T1C4)菌株對四環素、先鋒 V、氯霉素、頭孢噻吩、氟哌酸、復方新諾明等六種抗生素的抑菌環直徑明顯小于DH5α、DH5α(pUC18)。

圖3 探針與待檢測DNA的斑點雜交Fig.3 Dot bolt hybridization with T1C4 gene probe

表1 菌株藥敏試驗

3 討 論

基因水平轉移研究是研究基因的結構與功能的重要工具,通過研究不僅可以發現哪些基因可以發生水平轉移,而且還能發現該基因在微生物群落中的行為表現。盡管點突變可以影響細菌菌株的毒力表型,但是通過水平轉移獲取毒力基因在病原菌的進化過程中更為普遍〔12〕。因此,基因水平轉移研究可使我們在一定程度上預測將來可能出現的新病原菌,并對預防新型傳染病的出現具有一定的指導意義。

基因水平轉移在微生物中尤其常見,其被認為是微生物適應新環境的一種需求〔13-14〕。目前,已知參與水平轉移的基因大多與細菌的抗藥性和致病性有關〔12〕。為了系統的研究耐藥基因在細菌間的轉移情況,本課題組設計了一種基于同一遺傳背景下的細菌基因水平轉移模型,并從志賀菌敏感株中獲得了一株轉移耐多藥菌株。此前的比較基因組學研究表明,該轉移株可能從供體菌中獲得了多個基因。本實驗應用PCR、斑點雜交等方法證明,該轉移株所含有的T1C4基因片段來自供體菌,而且該基因片段在供體菌株和轉移株中都存在于質粒上,這一結果確定了該基因片段在基因組上的位置,也證明了質粒在細菌基因水平轉移中的重要意義。

通過比較3株不同的大腸埃希菌對14種抗生素的敏感性,發現與DH5α和 DH5α(pUC18)菌株相比,DH5α(pUC18-T1C4)菌株對其中6種抗生素具有一定的抗性。這一結果顯示,T1C4基因片段可能介導細菌對多種抗生素的耐性。但是,本實驗僅對該基因片段可能介導的耐藥性做了耐藥類型的篩選,具體在細菌耐藥過程中扮演何種角色,尚需要作更進一步的研究。

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Identification on horizontal transfer of multi-drug resistance related gene fragment ofShigellaand its drug-resistance

WANG Shu-ling,SONG Chun-hua,DUAN Guang-cai,ZHANG Wei-dong,XI Yuan-lin,ZHU Jing-yuan
(Department of Epidemiology,College of Public Health,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

The objective of the present study was to identify horizontal transfer of gene fragment(T1C4)fromE.colitoShigellaand its relationship with multi-drug resistance.Screened positive clone which contains T1C4 gene fragment was cultured and the plasmid was extracted.The fragment of T1C4 gene was then amplified by PCR and purified by gel purification kit.The probe was prepared and the dot hybridization was conducted for genomic DNA and plasmid DNA ofShigellasensitive strain(SS23),transferred multi-drug resistantShigellastrain(ST11)andEscherichia colimulti-drug resistant clinical strain(E667).Finally,antimicrobial sensitivity of DH5α,DH5α(pUC18),DH5α(pUC18-T1C4)and ATCC25922 were detected by disk diffusion testing.The procedure was carried out in accordance with the guidelines in standard of antibiotics susceptibility test(Kirby-Bauer method)document.Results displayed that T1C4 gene fragment was amplified from genomic DNA of ST11 and E667 by PCR.The genomic DNAs and plasmid DNAs of transferred strain(ST11)and clinical strain(E667)all gave positive signals in dot hybridization,whereas both of genomic DNA and plasmid DNA of SS23 gave negative hybridization signal.The bacteriostatic diameters of Tetracycline,Cefazolin,Cefalotin,Norfloxacin and SMZ-TMP to DH5α(pUC18-T1C4)were significantly shorter than those to DH5α(pUC18).It's concluded that gene fragment(T1C4)was transferred from E667 to ST11 with plasmid.Moreover,T1C4 gene fragment might be closely related to multi-drug resistance of bacteria.

dot hybridization;horizontal gene transfer;Shigella;multi-drug resistance

R378.2

A

1002-2694(2010)09-0814-04

*衛生部科研基金資助課題(WKJ2007-2-024)

段廣才,Email:gcduan@public.zz.ha.cn

鄭州大學公共衛生學院,河南省分子醫學重點學科開放實驗室,鄭州 450001

2009-07-19;

2010-01-09