釘螺不同季節及不同螺齡酚氧化酶活力研究*

周書林,趙 磊,趙 濤

2.石家莊市第五醫院;

3.皖南醫學院附屬弋磯山醫院生殖醫學科

釘螺不同季節及不同螺齡酚氧化酶活力研究*

周書林1,趙 磊2,趙 濤3

目的對釘螺不同季節及不同螺齡酚氧化酶活力進行研究。方法將釘螺分為不同季節組及成、幼螺組。釘螺去殼,取軟體組織通過勻漿、離心分別獲取粗制酶液,以鄰苯二酚為底物用比色法測定各組酶活力,結果進行方差分析。結果不同季節組(春季、夏季、秋季、冬季)釘螺體內酚氧化酶活力差異明顯(P＜0.01),分別為 383.32±3.09、271.43±4.16、351.34±2.89、237.37±5.05(U/g)。成、幼螺體內酚氧化酶活力差異明顯(P＜0.01),分別為271.43±4.16、473.31±6.13(U/g)。結論釘螺酚氧化酶活力在不同季節及不同螺齡均有差異。

釘螺;酚氧化酶;酶活力

2.石家莊市第五醫院;

3.皖南醫學院附屬弋磯山醫院生殖醫學科

Email:zhouslokk@yahoo.com.cn

釘螺是日本血吸蟲惟一的中間宿主,人們采用各種方法消滅釘螺,以阻斷血吸蟲病的傳播。目前主要有物理、化學及生物滅螺等消滅釘螺的方法,其中應用最多的是化學滅螺〔1〕。酶系統的活性與化學藥物的毒性直接相關,多功能氧化酶活性可間接表示藥物的毒性程度〔2〕。酚氧化酶(phenol oxidase,PO),作為一種與機體免疫防御等功能密切相關的氧化酶,廣泛存在于生物體內〔3〕,但釘螺體內PO相關活性研究報道甚少,本實驗中我們對不同季節及不同螺齡釘螺體內酚氧化酶活力進行探討,為將來以該酶為靶點的新型、高效低毒滅螺制劑的研發提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料 釘螺采自安徽省蕪湖市江灘,分別于春季(4月)、夏季(7月)、秋季(10月)冬季(1月)采集4次,以群體逸蚴法,每周逸蚴1次,共逸蚴3次,剔除感染釘螺,選取活力強,螺高為8.6～9.7 mm,螺寬為3.5～4.2 mm的成螺用于不同月份釘螺實驗。于7月選取活力強,螺高8.6～9.7 mm,螺寬為3.5～4.2 mm的成螺及螺高3.5～5.5 mm,螺寬1.4～2.4 mm幼螺若干用于成幼螺對比實驗。

1.2 主要試劑和儀器 鄰苯二酚,分析純,中國醫藥集團上海化學試劑公司產品;紫外分光光度計為上海精密科學儀器有限公司產品,型號UV-754;高速冷凍離心機為Hema公司產品;電子天平為日本Shimadzu公司產品;SZ-2自動雙蒸純水蒸餾器為上海滬西分析儀器廠產品;微量移液器(10μ L、100μ L 、200μ L 、1 000μ L)為上海求精生化儀器有限公司產品;電熱恒溫水浴鍋為上海醫療器械五廠產品。

1.3 方法

1.3.1 粗制酶液的制備 按參考文獻〔4〕的方法解剖釘螺若干只,剔去螺殼,選取無損傷的軟體組織,并稱重。按重量體積1∶5的比例,即1 g組織加入5 mL預冷的0.2 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(pH 6.8),冰浴勻漿,4℃靜置30 min,4℃、8 000 r/min離心30 min,取上清液即為粗制酶液。

1.3.2 酶活力測定方法 參照Benjamin和Montgomery〔5〕的方法并略有改進:采用磷酸鈉鹽緩沖體系,在3 mL的測活體系(包含濃度為0.2 mol/L、pH 6.8 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液和16 mmol/L鄰苯二酚)中加入30 μ L酶液,28℃下檢測430 nm下光密度(OD)值,繪制OD值隨時間的增長直線,從直線斜率求得酶活力。酶活力單位(U)定義為以每分鐘催化底物氧化增加OD值為0.001。PO酶量以每克體重所含的酶活力單位數(U/g)表示〔6〕。上述步驟各組重復3次,每次重新制備酶液。

1.3.3 不同季節成螺酚氧化酶活力測定 分別選取春季(4月)、夏季(7月)、秋季(10月)冬季(1月)采集的成螺若干只,按上述方法提取酶液,置于-40℃超低溫冰箱凍干保存,待酶液全部收集完畢,于28℃下檢測430 nm單位時間OD變化值。比較不同季節成螺酚氧化酶活力變化情況。

1.3.4 成、幼螺酚氧化酶活力測定 分別選取成、幼螺若干只,按上述方法測定單位時間OD變化值,觀察成、幼螺酚氧化酶活力變化情況。

1.3.5 統計學處理 應用SPSS13.0統計軟件處理實驗數據,多組間均數比較采用方差分析,兩組間均數比較用SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1 不同季節釘螺酚氧化酶活力春季(4月)、夏季(7月)、秋季(10月)冬季(1月)酚氧化酶含量(U/g)分別為 383.32±3.09、271.43±4.16、351.34±2.89、237.37±5.05。結果表明:不同季節釘螺酚氧化酶的活力有顯著性差異(F=909.71,P＜0.01),各組之間比較有顯著性差異(P＜0.01),以春季酚氧化酶活力最高,冬季活力最低(圖1)。

2.2 成、幼螺酚氧化酶活力 分別測定成、幼螺酚氧化酶的活力,結果成、幼螺酚氧化酶含量(U/g)分別為271.43±4.16、473.31±6.13。結果表明成、幼螺酚氧化酶的活力差異明顯(t=47.31,P＜0.01),成螺酚氧化酶活力低于幼螺。

3 討 論

圖1 不同季節釘螺PO活力的變化Fig.1 Changes on PO activity of Oncomelania snails in different seasons

本實驗研究表明,釘螺體內PO在春秋季活力最高,夏季次之,冬季 PO活力最低,這與楊坤〔7〕等發現釘螺體內NOS、SDH等酶活力隨溫度的增高,其酶活力增強基本一致。PO主要通過產生黑色素來殺死入侵的微生物,在無脊椎動物體液免疫中起著重要的作用〔8〕。另外PO還參與醌鞣化作用,促進其表皮的硬化與黑化,在無脊椎動物防御反應中起到重要作用〔8〕。溫度能嚴重影響釘螺的生活與活動,適宜釘螺生活的溫度是20～25℃,過冷和過熱均不利于釘螺的活動〔2〕。由此我們推測,釘螺在春秋季節活動性較強,與外界環境接觸機會較多,亦通過體內合成大量PO,來抵御外界微生物的入侵。而夏、冬季節,釘螺多處于夏蟄和冬眠狀態,極少開厴活動,從而降低了體內酶的代謝,減少了與外界環境的接觸,這亦可能是體內PO減少的原因。

PO還通過硬化反應來硬化角質,它是唯一參與角質硬化的酶。硬化對昆蟲的成活非常重要的,它為柔軟的無脊椎動物身體提供保護。在硬化過程中,PO產生的醌與角蛋白及甲殼質相互作用,最終交聯形成角質,高度硬化的角質能阻斷微生物和異物的入侵。本研究我們發現,釘螺隨著螺齡的增長,其體內PO活力逐漸降低,這一結果與不同日齡埃及伊蚊和不同齡期斯氏按蚊中PO活力變化隨蚊齡增加酶活力降低的研究結果一致〔8-9〕,而與菜青蟲和馬尾松毛蟲的PO研究結果基本相反〔10-11〕。不同螺齡體內PO的變化,可能是因為低齡幼螺的體壁較薄,不易抵抗病菌的入侵,高活力的PO能提高幼螺的免疫力,而且隨著釘螺螺齡的增加,螺殼的硬化,以及體壁的增厚及黑化,都可能需要PO的參與。然而成螺螺殼發育基本完成,體壁亦也增厚、黑化,抵御外界病菌的能力較強,因此其PO活力降低。

〔1〕畢研云,圖立紅,李樞強,等.我國常用的滅螺方法〔J〕.生物學通報,2006,41(11):17-18.

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〔11〕陳尚文,楊振德.馬尾松毛蟲和荔蝽體內多酚氧化酶的初步研究〔J〕.廣西科學,1996,3(2):45-50.

Phenol oxidase activity ofOncomelaniasnails in different ages and seasons

ZHOU Shu-lin,ZHAO Lei,ZHAO Tao
(Department of Parasitology,Wannan Medical College,Wuhu241002,China)

In order to study the phenol oxidase(PO)activity ofOncomelaniasnails in different ages and seasons,snails were divided into groups and crude enzyme was obtained through homogenation and centrifugation.By using colorimetric method with catechol as substrate,PO activities of these groups were detected and results were compared by variance analysis.There were significant differences among PO activities in different seasons(spring,summer,autumn and winter)with the results of 383.32±3.09,271.43±4.16,351.34±2.89,and 237.37±5.05(U/g),respectively(P＜0.01).There were also significant differences in the activity of PO between two age groups with the results of 271.43±4.16 and 473.31±6.13(U/g),respectively(P＜0.01).It's suggested that there are significant differences among the activity of PO in different seasons and ages.

Oncomelaniasnails;phenol oxidase;enzyme activity

R383.2

A

1002-2694(2010)09-0856-02

*安徽省教育自然科學基金(kj2009B152)和皖南醫學院中青年科研基金(wk200710)

1.皖南醫學院醫學寄生蟲學教研室,蕪湖 241002;

2010-01-15;

2010-06-22