日本血吸蟲rSj14-3-3疫苗和rSj26GST疫苗聯合免疫保護作用研究*

蔣就喜,房修羅,沈繼龍,胡婷婷

2.安徽醫科大學微生物與寄生蟲學教研室,合肥230032;

日本血吸蟲rSj14-3-3疫苗和rSj26GST疫苗聯合免疫保護作用研究*

蔣就喜1,房修羅1,沈繼龍2,胡婷婷1

目的觀察日本血吸蟲重組信號蛋白14-3-3(rSj14-3-3)疫苗和重組M r2600谷胱甘肽S轉移酶(rSj26GST)疫苗聯合免疫對小鼠的保護作用。方法將含有Sj14-3-3和S j26GST編碼基因的菌株E.coliBL21/p ET28a涂布LB/Kana/IPTG/X-gal平板,培養、收集細菌、超聲碎菌、分離、純化,分別取5μ L進行SDS-PAGE,觀察純化結果,采用 BCA法測定重組蛋白的濃度。聯合免疫組BALB/c小鼠分別在第0、2、4周用 rSj14-3-3疫苗 rSj26GST疫苗聯合免疫;而單獨免疫的 rSj14-3-3組及rSj26GST組,與上組同步各自免疫3次。末次免疫后2周進行感染攻擊,45d后剖殺,計數成蟲及肝內蟲卵。同時設PBS對照組。計算各組間的減蟲率和減卵率,以及蟲卵肉芽腫的大小。結果聯合免疫組的減蟲率為38.38%,顯著高于rSj14-3-3(16.98%)和rSj26GST組(26.80%)(P＜0.01)。聯合免疫組以及 rSj14-3-3、rSj26GST組減卵率分別為48.81%、25.27%、41.41%;聯合免疫組 rSj14-3-3和 rSj26GST組 ,肝組織中每條雌蟲平均產卵數顯著低于 PBS對照組(P＜0.01)。聯合組小鼠蟲卵肉芽腫的直徑為(173.9±35.0μ m),顯著小于對照組(267.7±28.6μ m)(P＜0.01),聯合組亦明顯低于rSj14-3-3和rSj26GST組(P＜0.01)。結論聯合免疫組的保護作用優于rSj14-3-3和rSj26GST單獨免疫組。且聯合免疫疫苗具有一定的抗蟲卵肉芽腫及抗肝纖維化作用。

日本血吸蟲;信號蛋白14-3-3;谷胱甘肽 S轉移酶;重組蛋白;聯合免疫

2.安徽醫科大學微生物與寄生蟲學教研室,合肥230032;

Email:gljiangjx@sohu.com

血吸蟲病是由復殖寄生吸蟲引起的以蟲卵肉芽腫和肝纖維化為主要特征的免疫性疾病,世界衛生組織(WHO)將其列為僅次于瘧疾的一種重要熱帶病。該病曾在全球76個國家和地區流行,共約2億血吸蟲病患者,6億人健康受威脅;僅我國還尚有448個血吸蟲病流行縣(市、區),共有33 810個流行村,估計患者67萬人〔1〕。國內外防治血吸蟲病的主要策略是:采取人畜同步化療、易感地帶滅螺、環境改造以及健康教育等相結合的綜合性防治措施,但面臨如成本高、防治效果欠理想、治愈病人再感染嚴重、血吸蟲蟲株耐藥性出現的潛在威脅等問題。因此研制血吸蟲病疫苗可作為化療的補充,能更有效地控制血吸蟲感染。

一般認為,蟲荷降低50%即可明顯減輕機體的病理損害和降低患病率,并且還可以減少流行〔2〕,但是僅靠獲得的其中一種血吸蟲疫苗候選分子在動物模型體內產生的免疫保護力大部分未達WHO所提出的預期目標≥40%減蟲率,如用rSj14-3-3免疫BALB/c小鼠可獲得34.2%的減蟲率和50.74%的減卵率〔3〕,劉述先等〔4〕等用 rSj26kDaGST 進行免疫小鼠,獲得24%～32%的減蟲率,57%～79%的減卵率,肝臟肉芽腫顯著減小。許多研究為了提高血吸蟲疫苗的免疫保護效果,他們試圖采用聯合免疫方案,將不同靶的、不同來源的疫苗通過不同的方式聯合應用〔5-6〕。本研究用日本血吸蟲rSj14-3-3疫苗和重組蛋白(rSj26GST)疫苗聯合免疫小鼠,探討其協同保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 陽性釘螺 含尾蚴的陽性釘螺購自江西省血吸蟲病防治研究所。

1.1.2 實驗動物 實驗動物系無特定病原體(specific pathogen free,SPF)6～8周齡雌性BALB/c小鼠60只,體重16～18g,購自安徽醫科大學實驗動物中心。

1.1.3 抗原(菌株) 表達重組抗原Sj14-3-3和Sj26GST編碼基因的菌株E.coliBL21/p ET28a由安徽醫科大學饋贈。

1.1.4 試劑 rSj14-3-3和rSj26GST蛋白純化試劑盒 His?Band Purification Kit購至Novagen公司。卡那霉素、SDS、低分子量蛋白質Marker、Tris堿等均為華美公司產品。低分子量蛋白質Marker購自北京全式金生物技術有限公司。BCA試劑盒購自碧云天公司。福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑均為美國Sigma公司產品。

1.2 rSj14-3-3和rSj26GST的制備和純化 含有rSj14-3-3和rSj26GST編碼基因的菌株E.coliBL21/pET28a分別涂布于LB/Kana/IPTG/X-gal平板,37℃培養過夜。挑取單個白色陽性菌落,分別置以含Kana的LB培養基37℃,225 r/min振蕩培養過夜,按1∶50比例接種 LB/Kana培養基,培養至OD600約為0.6,取出1mL作為誘導前對照,加入IPTG至終濃度為1mmol/L繼續培養誘導表達,分別取誘導后 1、3、5、7h 菌液進行 SDS-PAGE確定最佳誘導時間為5h。再次取表達rSj14-3-3和rSj26GST菌進行搖菌收集誘導5h后的菌液,于4℃,4 000r/min離心集菌,以PBS重懸沉淀。將重懸菌液置冰水浴中在380W功率下超聲粉碎,超聲3s,間歇3s,60次1個循環,每個循環間歇10 min,共4個循環。將超聲破碎后的表達產物于4℃,10 000 r/min離心10 min,取上清按His?Band Purification Kit說明書,用6×His親和層析柱純化表達產物(rSj14-3-3和rSj26GST),最后洗脫時分組(1.0 ml/組)收集洗脫液,分別 5μ L進行 SDSPAGE,觀察純化結果。采用BCA法測定重組蛋白的濃度。

1.3 動物保護性試驗

1.3.1 免疫 60只6～8周齡BALB/c雌性小鼠隨機分為 A 、B、C、D4組,每組15只。A 組(PBS對照組),于第0周每鼠經背部皮下多點注射50μ L PBS及等體積福氏完全佐劑(CFA),第2及4周每鼠皮下多點加強注射50μ L PBS加等體積福氏不完全佐劑(IFA)。B組(rSj14-3-3組)和 C組(rSj26GST組),同 A 組,唯將 PBS改為 50μ g(50μ L)rSj14-3-3和 rSj26GST。D 組(rSj14-3-3+rSj26 GST聯合免疫組),于第 0及第 2、4周經背部皮下多點注射 rSj14-3-3和 rSj26GST各50μ g及等體積CFA。

1.3.2 攻擊感染 末次免疫后4周,每鼠經腹部皮膚感染日本血吸蟲尾蚴(30±2)條,45 d后剖殺,門靜脈灌注法收集成蟲,計算減蟲率。取小鼠肝臟,稱重,加5%KOH 20mL,于37℃消化過夜,取0.1mL計數蟲卵,計算每條雌蟲在肝組織中的減蟲率和減卵率:減蟲率 =(對照組每鼠平均成蟲數-實驗組每鼠平均成蟲數)/對照組每鼠平均成蟲數×100%減卵率 =(對照組每雌蟲平均產卵數-實驗組每雌蟲平均產卵數)/對照組每雌蟲平均產卵數×100%

1.4 各組小鼠血吸蟲病肝組織HE染色 每組取出7只感染后小鼠肝組織,經10%甲醛固定,石蠟包埋、制作5μ m厚的連續石蠟切片,HE染色、封片,用以測量蟲卵肉芽腫大小。

1.5 單卵肉芽腫大小的測量方法 肝組織HE染色后,用目鏡十字測微尺每組觀察測量20個內含完整毛蚴的單蟲卵肉芽腫的垂直相交的最大縱徑(B)和最大橫徑(A),以最長徑加最寬徑的和除以2為肉芽腫平均直徑。目鏡測微器1格=0.15mm。按文獻〔7〕方法計算蟲卵肉芽腫面積:A=Л AB/4,體積:V=Л AB2/6。

1.6 采用SPSS14軟件進行t檢驗分析。

2 結 果

2.1 rSj14-3-3誘導表達產物的SDS-PAGE分析分別將含有 rSj14-3-3的BL21/pET28a菌誘導表達前和誘導后1、3、5、7h取樣,用1×SDS-PAGE上樣緩沖液處理,取10μ L上樣液進行 SDS-PAGE電泳。結果如圖1所示:在30.0 kDa～40.0 kDa蛋白條帶之間靠近30.0 kDa處,可見特異蛋白隨著誘導時間的增加表達量也逐漸增加,由于融合蛋白含有6 His-tag,重組蛋白分子量大小約為33 kDa,與理論值相符。

圖1 rSj14-3-3誘導表達產物的SDS-PAGE分析Fig.1 Analysis of purified rSj14-3-3 by SDS-PAGE

2.2 rSjGST誘導表達產物的SDS-PAGE分析分別將含有rSjGST的BL21/pET28a菌誘導表達前和誘導后 1、3、5、7h取樣,用1×SDS-PAGE 上樣緩沖液處理,取 10μ L上樣液進行SDS-PAGE電泳。結果如圖2所示:在20.0kDa～30.0kDa蛋白條帶之間靠近30.0kDa處,可見特異蛋白的表達,由于融合蛋白含有6His-tag,重組蛋白分子量大小約為26kDa,與理論值相符。

圖2 rSjGST誘導表達產物的 SDS-PAGE分析Fig.2 Analysis of purified rSjGST by SDS-PAGE

2.3 rSj14-3-3和rSjGST誘導表達純化產物的SDS-PAGE分析 分別將含有rSj14-3-3和rSjGST的BL21/pET28a菌誘導表達并純化,以空菌株E.coliBL21、誘導前、誘導后5h為對照,用1×SDS-PAGE上樣緩沖液處理,取5μ L上樣液進行SDS-PAGE電泳。結果如圖3。從泳道4、5可見約26 kDa處,可見純化后的清晰單一的 rSjGST蛋白條帶,從泳道7、8可見約33 kDa處,可見純化后的清晰單一的rSj14-3-3蛋白條帶。BCA法測定rSjGST蛋白濃度為1.12g/L和rSj14-3-3蛋白濃度為2.03g/L。M:protein marker;1:p ET28a/BL21;2:rSj14-3-3/p ET28a/BL21 uninduced with IPTG;3:expression of rSjGST,5h after IPTG induction;4-5:purified rSjGST;6:expression of rSj14-3-3,5h after IPTG induction;7-8:purified rSj14-3-3

圖3 純化后的rSj14-3-3和rSjGST蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 Analysis of purified rSj14-3-3 and rSjGST by SDS-PAGE

2.4 免疫保護效果

2.4.1 減蟲率 攻擊感染后45d剖殺小鼠,各組獲得的蟲荷及減蟲率見表1。經t檢驗分析,rSj14-3-3和rSj26GST聯合免疫組的蟲荷明顯低于rSj14-3-3或rSj26GST單獨免疫組(P＜0.05);rSj14-3-3和rSj26GST單獨免疫組之間蟲荷差異無顯著性(P＞0.05)。

2.4.2 減卵率 各組小鼠肝組織中每條雌蟲平均產卵數及減卵率見表2。聯合免疫組及單獨免疫組每條雌蟲平均產卵數低于對照組,差異顯著(P＜0.05);各單獨免疫組之間比較,每條雌蟲平均產卵數差異無顯著性(P＞0.05)。

表1 每組平均檢獲的成蟲比較Table 1 Comparison of average recovered adult worms between groups

表2 各組每鼠肝臟蟲卵數比較Table 2 Comparison of hepatic eggs per mice between groups

2.5 肝蟲卵肉芽腫大小的比較 聯合組、單獨rSj14-3-3組、單獨rSj26GST組與對照組比較,肝組織單卵肉芽腫平均直徑、面積、體積都不同程度的減少,聯合組和單獨rSj26GST減少更多,但以聯合組減少的最顯著。聯合組卵肉芽腫平均直徑、面積、體積的減少率分別達35.01%、56.62%、70.46%。聯合組與單獨 rSj14-3-3組比較差別也有統計學意義。

表3 每組肝蟲卵肉芽腫大小的比較Table 3 Comparison the size of hepatic egg granuloma per mice between groups

3 討 論

本實驗用rSj14-3-3和 rSj26 GST聯合免疫BALB/c小鼠,獲得了38.18%的減蟲率,與rSj14-3-3單獨免疫(減蟲率為16.98%)和rSj26GST單獨免疫(減蟲率為 26.81%)相比,差異顯著(P＜0.05)。表明 rSj14-3-3和 rSj26GST蛋白疫苗聯合應用能提高免疫效果。通過計算小鼠肝組織減卵率得到聯合組從25.27%和41.41%顯著提到48.81%,而且均低于對照組,進一步說明疫苗組具有抗血吸蟲感染作用外,還有一定的抗生殖能力。14-3-3蛋白質是廣泛存在于植物、酵母、原蟲、蠕蟲、昆蟲和包括人類在內的多種哺乳動物真核細胞內的一組多功能酸性蛋白質,分子量約為 30kDa,在1967年Moore等人研究腦蛋白系統分類時被發現。在寄生生物中,14-3-3也是維持細胞周期和蟲體生殖發育的主要信號轉導分子〔8〕。血吸蟲在長期的寄生生活演化過程中,蟲體內某些高度保守的功能基因及其表達產物在細胞間、細胞內的信號轉導及細胞功能調節中發揮重要作用〔9〕,現已知14-3-3蛋白質是一組高度保守的多功能蛋白質,是細胞內信號轉導的中樞調節因子,在細胞發育、增殖、分化、凋亡及免疫應答刺激階段都起著重要的作用〔10-11〕,因此可以通過14-3-3蛋白干預細胞信號轉導途徑而影響蟲體細胞快速增殖或增強細胞對凋亡的敏感性。rSj26GST疫苗針對血吸蟲的谷胱甘肽S轉移酶,從而干擾了血吸蟲谷胱甘肽S轉移酶的解毒功能。蛋白疫苗能誘導較強的體液免疫反應 ,但其誘導的細胞免疫反應常顯不足。這兩種疫苗的作用靶不同,似可產生互補體液免疫反應作用,故這兩者的聯合應用可產生一定的協同或增強作用。

聯合組小鼠蟲卵肉芽腫的直徑為(173.9μ m±35.0μ m),顯著小于對照組的(267.7μ m ±28.6μ m)(P＜0.01),聯合組亦明顯低于rSj14-3-3和rSj26 GST組(P＜0.01),表明聯合免疫疫苗具有一定的抗蟲卵肉芽腫及抗肝纖維化作用。血吸蟲病是一種以沉積于感染宿主肝、腸組織內蟲卵引起的肉芽腫及其纖維化為主要病變特征的免疫性疾病。成熟血吸蟲蟲卵釋出的可溶性抗原致敏T淋巴細胞使之釋放細胞因子,引起以淋巴細胞、嗜酸粒細胞、巨噬細胞、成纖維母細胞、中性粒細胞等聚集的肉芽腫反應。蟲卵肉芽腫的形成是宿主對血吸蟲致病因子的一種免疫應答反應。一方面,通過肉芽腫的形成將蟲卵包圍,以隔離和清除蟲卵釋出的抗原及毒素,避免對宿主組織的損害;另一方面,肉芽腫反應破壞了宿主正常的組織結構,不斷生成的蟲卵肉芽腫逐步纖維化而形成相互連接的疤痕,導致肝硬化、門脈高壓等嚴重的并發癥。日本血吸蟲蟲卵肉芽腫的大小與堆積的蟲卵數量有關,蟲卵數量愈多,肉芽腫體積愈大,病變也愈嚴重。

目前國內外科研人員對有潛力的血吸蟲疫苗候選抗原進行研究,如陳家旭等研究副肌球蛋白(paramyosin 97)Sjc97DNA核酸疫苗具有一定的抗蟲卵肉芽腫及抗肝纖維化作用〔12〕;用脂肪酸結合蛋白(SjFABP)免疫小鼠可獲得34%～49%的減蟲率,免疫大鼠和羊可獲得32%～59%的減蟲率〔13〕;用重組磷酸丙糖異構酶(Triose phosphate isomerase,TPI)TPI免疫不同種的小鼠,攻擊感染后小鼠減蟲率為 21.4%～ 27.8%〔14〕膜蛋白(Integral membrane protein)可作為宿主的免疫攻擊目標,能誘導宿主產生特異性IgE和IgA抗體,并有一定的抗血吸蟲感染能力〔15〕;但是從目前血吸蟲疫苗研究的成果來看,僅靠獲得的其中一種血吸蟲疫苗候選分子在動物模型體內產生的免疫保護力大部分未達到WHO所提出的預期目標。

國內外也有對運用聯合疫苗進行免疫的研究,如將日本血吸蟲SjTPI和SjC23DNA疫苗聯合免疫可提高保護力〔16〕;用rSj26 GST DNA 疫苗和重組蛋白疫苗聯合免疫小鼠,結果聯合組的減蟲率為50.8%,顯著高于單獨組〔17〕;他們都是運用重組蛋白疫苗和DNA疫苗進行聯合免疫,通過蛋白免疫產生的體液免疫和DNA疫苗產生的細胞免疫對宿主產生協同作用。但本實驗是使用兩種不同的重組蛋白進行免疫,通過兩種不同的作用靶點,它們似可產生互補體液免疫反應,可產生一定的協同或增強作用。

本研究結果表明,用重組蛋白 rSj26GST和rSj14-3-3聯合免疫小鼠,有一定協同作用,可增強其免疫保護作用,其作用機制有待進一步探討。且本實驗結果是疫苗免疫攻擊感染小鼠6周時的結果,其遠期效果如何需進一步研究。

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Protective efficacy of co-immunization with rSj14-3-3 and rSj26 GST vaccines againstSchistosoma japonicumin mice

JIANG Jiu-xi,FANG Xiu-luo,SHEN Ji-long,HU Ting-ting
(Infectious Diseases Section of Af f iliated Hospital,Guilin Medical College,Guilin541001,China)

To study the protective efficacy of co-immunization with recombinantSj14-3-3(rSj14-3-3)and recombinantSj26 protein(rSj26GST)vaccines againstSchistosoma japonicumin BALB/c mice,the LB/Kana/IPTG/X-gal plate was coated byE.coliBL21/pET28a strains which contained rSj14-3-3 and rSj26GST coding genes.The bacteria were then cultured,collected,smashed,separated and purified progressively.The results of SDS-PAGE purified proteins were observed and the concentration of recombinant proteins was determined by BCA.Mice in co-immunization group were co-immunized with rSj14-3-3 and rSj26GST vaccines at week 0,week 2 and week 4.While mice in rSj14-3-3 group and rSj26GST group were respectively immunized with rSj14-3-3 and rSj26GST vaccines in synchrony with co-immunization group.Two weeks after last immunization,mice were challenged by 30±2 cercariae ofS.japonicum(Chinese strain).On day 45 post-infection,mice were sacrificed and the number of worms and eggs in liver tissue was counted.The PBS control group was set and the worm reduction rate and egg reduction rate were counted.Results revealed that the worm reduction rate in co-immunized group was 38.4%,significantly higher than that in rSj14-3-3 group(17.0%,P＜0.05)and rSj26GST group(26.8%,P＜0.05).Liver egg reduction rate in co-immunized group,rSj14-3-3 group and rSj26GST group were 48.8%,25.3%and 41.4%,respectively.The average number of oviposition for female in liver of co-immunized mice was significantly lower than that in the control group(P＜0.01).The mean hepatic egg granuloma diameter of co-immunized group(173.9±35.0μ m)was significantly smaller than that of control group(267.7±28.6μ m)(P＜0.01).In addition,the diameter of co-immunized group was also smaller than that of rSj14-3-3 group(240.8 ±44.3μ m)and rSj26 GST group(191.6±26.3μ m)(P＜0.05).It's supposed that compared with the immunization of rSj14-3-3 or rSj26GST alone,the coimmunization with rSj14-3-3 andSj26GST could enhance pro-tective efficacy in BALB/c mice.Furthermore,co-immunized vaccine might act as an effective inhibitor against formation of egg granuloma and reduce immunopathological damage caused bySchistosoma japonicumin the host.

Schistosoma japonicum;rSj14-3-3;Sj26GST;recombinant protein vaccine;co-immunization

R532.2

A

1002-2694(2010)09-0825-05

*廣西自然科學基金(桂科自0728236)

1.桂林醫學院附屬醫院感染性疾病科,桂林 541001;

2009-09-22;

2010-01-27