藍氏賈第鞭毛蟲滋養體染色體掃描電鏡觀察*

沈海娥,李 冀,路 瑤,張文麗,任興波,布仁滿都呼,田喜鳳

2.北京林業大學生物科學與技術學院,北京 100083;

3.華北煤炭醫學院中心實驗室電鏡室,唐山 063000;

4.華北煤炭醫學院生物科學系生物技術專業,唐山063000

藍氏賈第鞭毛蟲滋養體染色體掃描電鏡觀察*

沈海娥1,李 冀1,路 瑤2,張文麗3,任興波4,布仁滿都呼4,田喜鳳1

目的電鏡觀察藍氏賈第鞭毛蟲滋養體的染色體數目及形態。方法 用改良TYI-S-33培養基培養賈第蟲滋養體。制備分散度較好的染色體玻片標本,對玻片標本進行掃描電鏡常規處理,掃描電鏡觀察。結果 在掃描電鏡下觀察到了藍氏賈第鞭毛蟲滋養體的染色體,染色體數目為2n=10條,1號染色體為亞中央著絲粒染色體,2號、3號、4號、5號為端著絲粒染色體。結論 通過電鏡觀察認為藍氏賈第鞭毛蟲滋養體的染色體核型公式為2n=10=2sm+8t。

藍氏賈第鞭毛蟲;滋養體;染色體;掃描電鏡

2.北京林業大學生物科學與技術學院,北京 100083;

3.華北煤炭醫學院中心實驗室電鏡室,唐山 063000;

4.華北煤炭醫學院生物科學系生物技術專業,唐山063000

藍氏賈第鞭毛蟲(Giardia lamblia,簡稱賈第蟲)的滋養體寄生于人體小腸,導致以腹瀉和營養不良為主要臨床表現的藍氏賈第蟲鞭毛蟲病。賈第蟲是一種單細胞真核生物,是目前所知的最原始的真核生物。由于特殊的進化地位,國內外許多學者都熱衷于它的細胞學研究,以探討原核細胞和真核細胞的進化。從1952年起,國內外學者就對其是否具有典型染色體以及染色體的數目展開了研究〔1〕。

本實驗室在光學顯微鏡下初步觀察到了賈第蟲滋養體的染色體,但染色體體積微小,呈點狀,屬于微小染色體〔2〕,所以關于染色體的形態還不甚清楚。近年來,應用掃描電鏡研究人類和動物的染色體日益增多〔3-4〕,利用掃描電鏡觀察染色體特別是微小染色體的數目、形態、結構等核型的觀察提供了新途徑。本研究應用掃描電鏡首次觀察了賈第蟲滋養體的染色體,并對其核型進行了初步分析,現將結果報告如下。

1材料與方法

1.1 蟲株 選用藍氏賈第鞭毛蟲C2株。基因型屬于第3型(GS)。該株蟲體系分離自我國四川省農村1名腹瀉患兒〔5〕,隨后用改良T YI-S-33培養基建立的純培養〔6〕。蟲株由首都醫科大學寄生蟲教研室用液氮冷凍保種。實驗前,將凍存的滋養體復蘇,置上述培養基內于37℃培養、傳代。

1.2 染色體標本制備 取蟲體生長旺盛的培養管,棄去舊培養基,加入含秋水仙素的新鮮培養基(秋水仙素終濃度為 0.2μ g/mL),繼續于 37℃培養 4～5h。終止培養后,常溫下用力震蕩培養瓶,使貼于管壁的蟲體脫落。然后收集細胞,0.075 mol/L KCl溶液低滲,固定液(甲醇:冰醋酸的體積比為3∶1)固定,離心收集細胞進行滴片,在37℃水浴鍋中用Giemsa染液染色1h,自來水沖洗,晾干〔2〕。

1.3 顯微鏡觀察 將染色玻片用油鏡觀察。從染色體標本中選取分散較好的中期分裂相細胞。在分裂相周圍作2mm直徑的標記,以便掃描電鏡觀察。

1.4 掃描電鏡標本制備 按 Harrison〔3〕的方法,依次:3∶1甲醇-冰乙酸脫色,用磷酸緩沖液洗。2.5%戊二醛固定30min。0.1 mol/L(pH7.4)PBS漂洗3次。1%鋨酸固定 5min。蒸餾水洗 3次。2%單寧酸處理5 min。蒸餾水洗3次。1%鋨酸處理10 min。水洗 3次。30%-100%乙醇逐級脫水,每級5min。臨界點干燥(也可用空氣干燥)。把標本片標記的核型所在處用玻璃切下約5×5mm2,置日立E-1010型離子濺射儀中噴金。

1.5 掃描電鏡觀察 KYKY-2800掃描電鏡觀察。選擇5個分散良好的分裂相,用游標卡尺直接測量染色體長度。計算5對染色體的相對長度、臂比值。按照染色體大小和形態依次配對、編號、排核型圖,翻拍,放大。

2 結 果

2.1 光學顯微鏡觀察賈第蟲滋養體細胞核輪廓已不清晰,核內外有分散的染色體,染色體數目為10條,染色體體積微小,呈粗大的點狀或短棒狀(圖1左側細胞核)。

2.2 掃描電鏡觀察

2.2.1 染色體數目 兩個細胞核輪廓清晰,內有分散的染色體,見圖2。兩個細胞核的染色體都溢到核外,左側一組染色體分散良好,形態清晰。核內染色體數目為2n=10條,見圖3。綜合光學顯微鏡和掃描電鏡觀察結果證明賈第蟲滋養體每個核內染色體數目為2n=10條,為二倍體。

2.2.2 染色體相對長度組成及核型分析經測量分析可將賈第蟲滋養體的10條染色體配為5對,染色體平均長度為 0.76μ m,為微小染色體,見表1。根據染色體核型的相對長度、臂比值及著絲粒的位置進行分析,剪貼,配對制成核型圖,見圖4。該核型中1號染色體為亞中央著絲粒染色體,2-5號為端著絲粒染色體。其核型公式是2n=10=2sm+8t。根據核型圖繪制核型模式圖,見圖5。

圖1 染色體體積微小,呈短棒狀(×1 000)光鏡下Fig.1 The chromosomes are short rod in shape and the size is tiny(×1000)light microscope圖2 兩個細胞核輪廓清晰,內有分散的染色體(×5000)掃描電鏡下Fig.2 There are scattered chromosomes in the two nuclei with clear outline(×5000)scanning electron microscopy圖3 兩個細胞核的染色體都溢到核外,左側一組染色體分散良好,形態清晰(×5000)Fig.3 Chromosomes are outside of the two nuclei,the left of a group of chromosome is well-dispersed and the morphology is clear(×5000)圖4 藍氏賈第鞭毛蟲滋養體染色體中期分裂相及核型圖Fig.4 Metaphase chromosomes and the karyotype of Giardia lambliab trophozoite圖5 藍氏賈第鞭毛蟲滋養體染色體核型模式圖Fig.5 Idiogram of Giardia lambliab trophozoite

表1 藍氏賈第鞭毛蟲滋養體的核型指數Tab.1 Relative length,arm ratio,classified set of chromosome of Giardia lamblia

3 討 論

90年代國內學者利用電鏡對藍氏賈第鞭毛蟲滋養體的核分裂進行了初步觀察,發現核分裂過程最主要的特征是無凝聚的典型中期染色體出現〔7〕。但隨后吳剛等人利用SDS凝膠電泳證實藍氏賈第鞭毛蟲滋養體已存在5種組蛋白〔8〕,陳泳宏等人采用改進的染色質鋪展技術制備核小體并進行透射電鏡觀察,結果表明藍氏賈第鞭毛蟲滋養體已有了直徑約10nm的核小體結構〔9〕,Adam等確定了端粒的序列為TAGGG,存在于賈第蟲所有染色體分子上〔10〕,這些研究在分子水平上間接證明了具有染色體的可能性。作者在實驗室經過長期的摸索和試驗,首次在光學顯微鏡和掃描電鏡下觀察到成形的藍氏賈第鞭毛蟲滋養體C2株染色體。

Le Blancq〔11〕和 Adam〔12〕等用脈沖場凝膠電泳對WB株全基因組DNA進行分析,根據實驗結果推測每個細胞核內至少有5條不同長度的染色體。但關于細胞核是幾倍體還尚未定論。Fan等1991年對限制性酶解的藍氏賈第鞭毛蟲滋養體DNA片段進行密度掃描,推測其為單倍體,染色體數目為5條〔13〕。Adam從其每個染色體的分子量和總的分子量相比較認為其為多倍體〔14〕。Bernander等利用流式細胞儀和熒光顯微鏡研究認為在滋養體階段每一個細胞核都為二倍體,而不是單倍體〔15〕。截至目前,基本認同的觀點是賈第蟲滋養體至少含有5條不同長度的染色體。作者經過對大量的分裂相細胞進行觀察統計,初步認為賈第蟲C2株每一個細胞核內含有10條染色體,根據染色體體積大小、形態、染色等特征推測其為二倍體(2n),并進行了初步的配對和編號。

在實驗過程中偶爾發現兩個細胞核內的染色體數不一樣,見圖1,例如一側為10條,另一側為 9條或8條,原因可能是:制片中染色體溢出核外,部分染色體丟失,導致2個細胞核的染色體數不同;在數次細胞分裂過程中染色體發生斷裂,一側細胞核的染色體發生丟失,最終兩個核的染色體數不同。此現象還需進一步實驗觀察。

Adam等用脈沖場凝膠電泳對WB株全基因組DNA進行分析,推測藍氏賈第鞭毛蟲滋養體每個細胞核內至少有5條不同長度的染色體,同時推測了每一條染色體的大小,1和2號染色體長度各為1.6Mb,3號為1.6Mb,4號為3.0Mb,5號為3.8Mb,單倍體基因組不超過12Mb〔14〕,最小的染色體定為1號,由小到大依次編號。而我們則按照核型的常規規定,體積最大的染色體定為1號,按體積大小依次編號,所以我們對染色體的編號正好與Adam相反,我們所定的1號染色體即Adam的5號染色體,其它以此類推。

在掃描電鏡下觀察發現1號染色體為亞中央著絲粒染色體,2-5號為端著絲粒染色體。由于染色體體積微小,在光學顯微鏡下呈粗大的點狀,對于一些常見的染色體分帶技術如顯示次縊痕的N帶、常規的G顯帶技術無法有效的應用,所以有關染色體的詳細特征比如有無次縊痕,有無隨體,有無核仁組織區還需進一步研究。

〔1〕Filice FP.Studies on the cy tology and life history of aGiardiafrom the laboratory rat〔J〕.Univ Calif Public Zool,1952,57:53-146.

〔2〕沈海娥,李冀,田喜鳳,等.藍氏賈第鞭毛蟲染色體核型初步觀察〔J〕.中國人獸共患病學報,2009,25(4):352-353.

〔3〕Harrison CJ,Britch M,Allen TD,et al.Scanning electron microscopy of the G-banded human karyotype〔J〕.Exp Cell Res,1981,134(1):141-53.

〔4〕秦志輝,周洪福,孟陽春.兩種硬蜱的染色體掃描電鏡觀察初報〔J〕.蘇州醫學院學報,1991,11(1):4-6.

〔5〕祝虹,盧思奇,郭增柱,等.藍氏賈第鞭毛蟲四川株純培養的建立〔J〕.中國寄生蟲病防治雜志,1992,5:42-44.

〔6〕Keister,DB.Axenic culture ofGiardia lambliain TYI-SS-33 medium supplemented with bile〔J〕.T ran R SocT rop Med Hug,1983,77(4):487-488.

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〔11〕Le Blancq,S M,Adam R D.Structural basis of kary otype heterogeneity ofGiardia Lamblia〔J〕.Mol Biochem Parasitol,1998,97:199-208.

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Scanning electron microscope observation on chromosome ofGiardia lambliatrophozoite

SHEN Hai-e1,LI Ji1,LU Yao2,ZHANG Wen-li3,REN Xing-bo4,Burenmanduhu4,TIAN Xi-feng1

(1.Department of Biological Science,North China Coal Medical University;
2.Biosciences and Biotechnology of Beijng Forestry University,Beijing100083;
3.Electron Microscopy Room,Central Laboratory,North China Coal Medical University;
4.Bio-technology,Biosciences Department of North China Coal Medical University,Tangshan063000,China)

In order to observe the quantity for chromosome and shape ofGiardia lambliatrophozoites under scanning electron microscopy,trophozoites were culturedin modified TYI-S-33 medium at 37℃and chromosome slides with better dispersion were prepared.Chromosome on the conventional treatment processed slide was observed under scanning electron microscopy.The chromosome ofGiardia lambliatrophozoite was observed with a quantity of 2n=10.The pair 1 was submetacentric chromosome,while the pair 2,3,4 and 5 were all telocentric chromosomes.It＇s demonstrated that the karyogram formula is 2n=10=2sm+8t under scanning electron microscope.

Giardia lamblia;trophozoite;chromosome;scanning electron microscopy

R382.2

B

1002-2694(2010)07-0696-03

*國家自然科學基金(No.30970313)資助

田喜鳳,Email:tstianxifeng@163.com

1.華北煤炭醫學院生物科學系,唐山 063000;

2010-01-28;

2010-05-11