雌激素受體α基因多態性與良性前列腺增生相關研究

季敬璋，白永恒，俞雅萍，莫亞林，呂建新

(1.溫州醫學院 檢驗醫學院、浙江省醫學遺傳學重點實驗室，浙江 溫州 325035；2.紹興文理學院 醫學院，浙江 紹興 312000)

良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia，BPH)是一種十分常見的老年男性泌尿系統疾病。研究表明，BPH的發生與雌激素調節密切相關，而雌激素在體內的生理作用主要是通過其特異性受體——雌激素受體（estrogen receptor，ESR）的介導來實現的[1-2]，因此，研究雌激素受體有助于揭示BPH的發病機制。本研究通過對ESR α基因進行單核苷酸多態性分析，來觀察其在BPH發生、發展中的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料 自2007年5月至2008年5月間收集溫州醫學院附屬第一醫院BPH患者112例和健康體檢人群作為對照111例的外周血標本。BPH組年齡分布為52～89歲，平均71.0歲，均為經過組織病理證實的BPH患者。健康對照組年齡分布為48～83歲，平均66.6歲，其判定的標準主要為低水平的血清PSA值（<4.0μg/μL）、前列腺B超檢查正常以及無相應的臨床癥狀。所有研究對象均已事先告知該研究的相關內容，并取得其本人同意。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取：用全血基因組提取試劑盒（TaKaRa公司產品）提取外周血總DNA，置于4 ℃保存，備用。

1.2.2 基因型分析：參照文獻[3]合成引物5’-CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC-3’ (正向)和5’-TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATTAT CTGA-3’(反向)。PCR反應體系：10×Ex Taq Buffer 5μL，25 mmol/L的MgC124μL，各含2.5 mmol/L的dNTP混合液4.5μL，10 mmol/L的引物各0.5 μL，80～200 ng DNA模板，5 U/μL的Ex Taq DNA聚合酶0.2μL，加水至50μL。PCR產物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。10μL PCR產物用限制性內切酶消化4 h，酶切產物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3 統計學處理方法 采用Hardy-Weinberg平衡檢驗來評價采集資料的可靠性。采用非條件Logistic回歸分析ESRα基因型和等位基因頻率，從而得到經過年齡校準的OR值以及95%CI。采用SHEsis軟件分析ESRα基因單體型[4]。

2 結果

2.1 ESRα基因型的酶切結果 PCR產物經過限制性內切酶PvuII消化可形成PP基因型(1372 bp)，Pp基因型(1372 bp，936 bp，436 bp)和pp基因型(936 bp，436 bp)；經過限制性內切酶XbaI消化可形成XX基因型(1372 bp)，Xx基因型(1372 bp，982 bp，390 bp)，xx基因型(982 bp，390 bp)，見圖 1。

圖1 ESRα基因酶切電泳圖

2.2 ESRα基因Hardy-Weinberg平衡檢驗 本研究對112例BPH患者和111例健康對照的ESR α基因PvuII和XbaI位點的基因型進行Hardy-Weinberg平衡檢驗。結果顯示PvuII和XbaI位點基因型的觀察值（actual）與預期值（expected）的差異均無顯著性（P>0.05），表明收集的資料具有代表性。

2.3 ESRα基因型和等位基因分布情況 本研究觀察了BPH病例組和對照組之間的ESRα基因型和等位基因分布規律，顯示其PvuII位點以雜合子基因型Pp占多數，為44.84%（100/223），純合子基因型PP最少，為14.35%（32/223）；XbaI位點以純合子基因型xx為主，為64.13%（143/223），純合子基因型XX最少，僅為4.48%（10/223）。分別比較PvuII和XbaI位點的基因型和等位基因在BPH病例和健康對照中的分布頻率，差異均無顯著性（P>0.05），見表1。

2.4 單體型分析 ESRα基因多態性位點PvuII與XbaI間具有較強的連鎖不平衡效應（D’=0.958，r2=0.398，來自對照組數據）。ESRα基因單體型包括pX、px、PX和Px四種，本研究人群主要以單體型px分布為主，而單體型pX分布最低。比較BPH病例組和健康對照組人群的單體型分布，本研究發現單體型pX在BPH患者中的分布顯著高于健康對照人群（P=0.032108），其OR值為6.394，95%CI為0.919～44.517；單體型px、PX和Px在兩者間的差異無顯著性（P>0.05），見表2。

表1 BPH組和健康對照組ESRα基因型和等位基因分布情況

表2 BPH組和健康對照組ESRα基因單體型分析

3 討論

ESR受體屬于一類由配體激活的核轉錄因子，現發現ESR受體存在三種亞型：ESRα、ESR β和ESRγ，其中ESRα亞型主要分布于前列腺基底上皮細胞和基質間隙[5]，ESRβ分布于前列腺體上皮間隙[6]，而ESRγ目前僅發現存在于硬骨魚中[7]，在人類前列腺中尚未發現。免疫組化顯示，ESRα在正常前列腺腺體上皮細胞中雖未表達，但在前列腺增生細胞中存在高表達[8]，這種表達差異提示ESRα可能與BPH的發生密切相關[9]。因此，研究ESRα基因多態性對于了解BPH的發病機制具有重要的意義。

ESRα基因定位于人類染色體6q25.1上，全序列有140 kb，由8個外顯子和7個內含子組成。PvuII（rs2234693）和XbaI（rs9340799）是ESRα基因最常見的兩個多態性位點，均分布于第1內含子上，兩者僅相距50 bp。PvuII存在堿基T和C的變異，XbaI存在A和G的變異，由于這些變異發生在含有啟動子、增強子等重要調節序列的第1內含子上，因而這可能影響到ESRα的表達和功能[10]。Herrrington等[11]認為PvuII位點T轉換為C（P等位基因），那么，基因序列上會形成一個能與myb轉錄因子相結合的位點，即B-myb，這可大大提高下游報告基因的轉錄水平。因此，P等位基因可提高ESRα轉錄活性。

我們分析了112例BPH患者和111例健康對照人群ESRα基因PvuII和XbaI位點單核苷酸多態性，結果顯示，PvuII和XbaI位點的基因型或等位基因分布頻率在BPH患者與健康對照人群之間差異均無顯著性，這提示單個SNP可能與BPH發病不相關。然而，在進化學上以等位基因方式表述與疾病易感性相關的多態性，很少由單個多態性導致，大多是基因內幾個多態性的組合即單體型所引起。此外，PvuII和XbaI兩個位點之間距離較近，這大大增加了位點間相互影響共同作用的可能性。因此，本研究分析兩個位點的交互作用，即做連鎖不平衡分析。結果顯示PvuII和XbaI位點之間存在較強連鎖不平衡作用，單體型分析顯示攜帶有pX的個體患前列腺增生的幾率為未攜帶該單體型個體的6.4倍，提示單體型pX是BPH發生的高危險因素。因此，有必要對此類易感人群進行早期干預，預防BPH的發生。

此外，本研究也注意到單體型pX在本地區人群中的分布頻率很低，所占比例不到3%，而人群中最常見的單體型為px，比例占到60%以上。與世界其他地區人群的結果相似的這種頻率分布特征[12-13]，提示單體型pX引起 BPH的發生雖然風險較大，但影響是局限的。目前老年男性BPH的發病率極高，除了與雄激素水平有關外，雌激素水平也可能是其重要的原因之一，而雌激素主要是通過受體ESRα的作用實現其生理功能，因此，推測除了PvuII和XbaI位點外，ESRα基因還存在其他多態性位點協同影響BPH的發生。

綜上所述，ESRα基因PvuII和XbaI多態性與BPH發病可能存在著一定的關聯，但這僅僅是初步的，還需更大量的樣本數、更多的位點以及更深入的基因功能研究，才能夠得到肯定一致的結論。

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