參附對失血性休克大鼠肝臟TF，TM，t-PA，PAI-1 mRNA表達的影響

王青，陳潔，潘景業

(溫州醫學院，浙江 溫州 325035，1.機能實驗中心；2.附屬第一醫院 ICU)

多年來，國內外關于休克的研究主要集中在炎癥因子和抗炎治療上。由于炎癥與機體的凝血和抗凝血的動態平衡關系密切，抗凝也逐漸成為休克治療新的靶點[1]。本實驗觀察了失血性休克時肝臟組織的組織因子(tissue factor，TF)、血栓調節蛋白(thrombomodulin，TM)、組織型纖溶酶原激活劑(tissue type plasminogen activator，t-PA)和纖溶酶原激活劑抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)等參與凝血、纖溶過程的物質的表達情況，以及參附注射液的干預作用，為臨床上對失血性休克的治療提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組：清潔級健康SD大鼠40只，雌雄不拘，雌鼠不孕，體重250～300 g。由中國科學院上海分院實驗動物中心提供。實驗動物先置溫州醫學院實驗動物中心層流實驗室飼養2 d，自由攝食、攝水，室內溫度25 ℃，相對濕度70%，12/12 h晝夜照明變化。大鼠隨機分對照組、休克組、林格液組、參附液組。若因模型不成功、死亡造成各亞組樣本量不足8只的，按隨機原則補足。

1.1.2 主要試劑：參附注射液購于江蘇先聲藥業公司(國藥準字號:H33020465)；Trizol Reagent試劑為Invitrogen公司產品；RT-PCR試劑盒由Fermantas公司提供；引物及內參均由上海基康公司提供。

1.2 模型的建立及處理 實驗前禁食過夜，自由飲水，操作前稱重，在暖燈照射下進行操作。按4 mL/kg腹腔注射20%烏拉坦麻醉。①對照組：麻醉后分離左側頸總動脈和右側頸外靜脈。用22-18 G動脈穿刺針行動脈插管，整個管道系統預充生理鹽水液。動脈插管經三通及壓力傳感器連接多功能監護儀監測平均動脈壓。在右側頸外靜脈穿刺、插管，后者用于輸液。不予其他操作，于插管后3 h，取肝臟組織標本。②休克組：按參考文獻[2]的方法，復制失血性休克動物模型。插管成功后，15 min內放血使平均動脈壓降至5.33 kPa(40 mmHg)，穩定60 min，使其波動范圍在（40±5）mmHg，即為模型復制成功；于2 h后取肝臟組織標本。③林格液組：模型復制成功后30 min內輸注3倍失血量的林格液治療，2 h后取肝臟組織標本。④參附液組：補液方案為參附注射液10 mL/kg，再輸入林格液補充至3倍失血量，所有液體在30 min內輸完；2 h后取肝臟組織標本，于-70 ℃冰箱中保存待檢。

1.3 RT-PCR檢測肝臟組織TF，TM，t-PA，PAI-1 mRNA含量 ①引物設計：大鼠各基因序列可在NCBI找到。采用Primer5.0計算機軟件設計PCR所用引物，最后用BLAST驗證。②Trizol試劑盒一步法分離提取總RNA：按照Invitrogen公司提供的Trizol試劑盒說明書步驟進行。③逆轉錄：將提取的總RNA取一部分立即進行逆轉錄。參考Takara公司提供的說明書進行操作。④PCR反應參考Takara公司提供的說明書進行操作，并按比例調整反應體系體積。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，計算機成像后以Gel3.0軟件分析電泳圖像的各mRNA相對表達量。

1.4 統計學處理方法 多組間相同指標的比較采用單因素方差分析，方差齊時采用Student Newman Keuls法，方差不齊同者采用Tamhane’s T2法。

2 結果

2.1 肝臟組織TF，TM，t-PA，PAI-1 mRNA表達結果 休克組肝臟組織TF，TM，t-PA，PAI-1 mRNA表達與對照組相比明顯升高，差異均有顯著性（均P<0.05）；林格液組肝臟組織TF，TM，t-PA，PAI-1 mRNA表達較對照組及休克組升高，差異均有顯著性(均P<0.05)；參附液組肝臟組織TF，TM，t-PA，PAI-1 mRNA表達與對照組比較，差異無顯著性，與休克組及林格液組比較明顯降低(P<0.05)。見表1和圖1。

表1 各實驗組肝臟TM，TF，t-PA，PAI-1 mRNA的表達及比較 (n=8±s)

表1 各實驗組肝臟TM，TF，t-PA，PAI-1 mRNA的表達及比較 (n=8±s)

與對照組比：▲P<0.05；與休克組比：☆P<0.05；與林格液組比：★P<0.05

組別對照組休克組林格液組參附液組F值TF mRNA 0.70±0.21 1.05±0.18▲1.27±0.33▲☆0.82±0.22☆★9.22 TM mRNA 0.80±0.20 1.03±0.26▲1.25±0.25▲☆0.81±0.18☆★6.06 t-PA mRNA 0.69±0.16 0.98±0.18▲1.17±0.24▲☆0.79±0.22☆★10.80 PAI-1 mRNA 0.78±0.25 1.04±0.29▲1.30±0.32▲☆0.79±0.21☆★6.98

圖1 各組TF mRNA，TM mRNA，t-PA mRNA，PAI mRNA的表達變化

3 討論

嚴重創傷病人易發生DIC，其中內皮細胞起著重要作用。內皮細胞不僅是創傷后炎癥反應的參與者，還是首先受損的靶細胞。肝臟是一個高血流的器官，血管內皮細胞豐富，在創傷失血性休克時易出現功能損傷。內皮細胞具有表達TF啟動外源性凝血途徑，且同時又分泌TM發揮抗凝的作用，分泌t-PA激活纖溶及PAI-1發揮抗纖溶的功能。內皮細胞受損后，調節凝血、抗凝的功能下降，使機體凝血-抗凝系統紊亂，微循環產生障礙。TF的表達水平與內皮細胞損傷關系密切。TM是一種內皮細胞膜糖蛋白，是經典的血管內皮細胞損傷的一個分子標志物[5]。t-PA和PAI是調節纖溶活性的關鍵物質，由血管內皮細胞合成。t-PA為絲氨酸蛋白酶，能選擇性地活化血凝塊中的纖溶酶原生成纖溶酶，進而使纖維蛋白水解，血流通暢；PAI是t-PA最重要的抑制物，二者形成1:1復合物，使t-PA失去活性[6]，有內皮細胞損傷時，t-PA和PAI-1大量釋放。

本實驗研究發現失血性休克大鼠肝臟組織中TM，TF，t-PA，PAI-1 mRNA表達增強，與Besbas等[7]認為TM，t-PA，和PAI-1水平的升高反映內皮細胞的損傷和纖溶系統的激活頗相似。本實驗林格液治療后TF，TM，t-PA，PAI-1 mRNA表達較創傷對照組及休克組明顯升高，提示林格液干預未見明顯改善，反而有惡化作用，可能與缺血再灌注致內皮細胞損傷有關。參附注射液是由紅參、附片等藥提取物混合而成，能夠穩定血流動力學，減輕肺缺血/再灌注[2]，增強機體非特異性抵抗力，抗休克雙向調節血壓。參附液復蘇組與休克組及林格液復蘇組比較，TF，TM，t-PA，PAI-1 mRNA表達明顯降低，提示組織及內皮細胞損傷后恢復且其對肝臟內皮細胞凝血、纖溶因子的表達產生影響，不易形成血栓，保持血管內血流通暢，改善微循環，同時，又防止纖溶過度亢進。有報道稱，用參附注射液治療大鼠肝缺血再灌注，發現肝實質細胞和肝竇內皮細胞損傷明顯減輕，肝竇形態的改變和肝竇內的瘀血、白細胞聚集也明顯減輕，也提示參附注射液通過保護肝竇內皮細胞，改善肝臟微循環灌注[8]。

[1] Esmon CT. Inflammation and thrombosis[J]. J Thromb Haemost,2003,1(7):1343-1348.

[2] 黃標通,龍建平,熊衛民,等.體外循環心臟瓣膜替換術中參附注射液的心肌保護作用[J].實用醫學雜志,2006,22(2):195-197.

[3] Stein SC, Smith DH. Coagulopathy in traumatic brain injury[J].Neurocrit Care,2004,1(4):479-488.

[4] Hess JR, Lawson JH. The coagulopathy of trauma versus disseminated intravascular coagulation[J].J Trauma,2006,60(6 Suppl):S12-S19.

[5] Lin SM, Wang YM, Lin HC, et al. Serum thrombomodulin level ratlates to the clinical course of disseminated intravasculation coagulation, multiorgan dysfunction syndrome, and mortality in patient with sepsis[J]. Crit Care Med,2008,36(3):683-689.

[6] 李金鋒.妊娠期高血壓疾病患者血漿組織型纖溶酶原激活物及其抑制物的活性變化[J].新鄉醫學院學報,2009,26(1):69-70.

[7] Besbas N, Erbay A, Saatci U,et al .Thrombomodulin, tissue plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor-1 in Henoch-Sch nlein purpura[J]. Clin Exp Rheumatol,1998,16(1):95-98.

[8] 彭松林,戴朝六,黃勇,等. 參附注射液對肝缺血再灌注大鼠微循環的影響[J]. 中國醫科大學學報,2006,35(4):353-356.