苦瓜蛋白誘導(dǎo)K562/A02細(xì)胞凋亡

尹麗慧，熊術(shù)道，葉愛芳，韓義香，章圣輝，吳建波

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 內(nèi)科實驗室，浙江 溫州 325000)

苦瓜蛋白是從苦瓜種籽中分離出來的一種堿性糖蛋白，屬于I型植物核糖體失活蛋白（ribosomal inactivating protein，RIP），其 RNA N-糖苷酶活性能使真核細(xì)胞核糖體28S rRNA第4323位腺嘌呤糖苷鍵水解、斷裂，從而無法與延長因子2結(jié)合并導(dǎo)致60S亞基失活，進(jìn)而使蛋白質(zhì)的合成受到不可逆的抑制。近年來，陸續(xù)有研究表明，I型RIP具有抗腫瘤作用，而其抗腫瘤作用依賴于其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。我們以往的研究也表明，苦瓜蛋白具有良好的抗腫瘤作用，并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[1-2]。Pongnikom等[3]研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者在化療過程中同時服用苦瓜45～90 d，其P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）水平明顯下降，而單純化療的患者P-gp表達(dá)沒有改變，提示苦瓜中某種成分具有下調(diào)P-gp表達(dá)的作用。但目前有關(guān)苦瓜蛋白對耐藥腫瘤細(xì)胞作用的研究國內(nèi)外少有報道。本研究以多藥耐藥(multi-drug resistance，MDR)K562/A02細(xì)胞為模型，從細(xì)胞凋亡、P-gp表達(dá)及caspase活性等方面研究苦瓜蛋白對K562/A02的細(xì)胞生物學(xué)作用，探討苦瓜蛋白對耐藥腫瘤細(xì)胞作用的分子機(jī)制，以期為白血病多藥耐藥治療尋找一種新的藥物。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料：多藥耐藥細(xì)胞株K562/A02購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所；苦瓜蛋白由本實驗室提取[2]。

1.1.2 試劑：RPMI1640（美國GIBCO公司）；胎牛血清（天津市正江高科技有限公司）；100×青霉素-鏈霉素雙抗液（美國GIBCO公司）；CCK-8（日本同仁化學(xué)研究所）；Annexin V kit（Bender Medsystems公司）；熒光標(biāo)記單抗（BD公司）；caspase-8 kit（聯(lián)科公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：K562/A02細(xì)胞用含10%FBS，100 U青霉素、鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，予37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，長滿后按懸浮細(xì)胞常規(guī)傳代法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞毒性試驗：取對數(shù)生長期K562/A02細(xì)胞，按1×105/mL接種96孔板，每孔加100μL，24 h后分別加入0、2、5、10、20、50和100μg/mL苦瓜蛋白，每組6復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入CCK-8，37 ℃孵育1 h，酶標(biāo)儀測OD值，計算細(xì)胞增殖抑制率，IC50。

1.2.3 AnnexinV/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡：取對數(shù)生長期細(xì)胞，按1×105/mL接種于24孔板，24 h后分別加入0、5、10和15μg/mL苦瓜蛋白，作用48 h后，每個標(biāo)本收集2×105個細(xì)胞，按試劑盒說明書進(jìn)行操作，用FACS Calibur型流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 細(xì)胞凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)的檢測（姬姆氏染色）：取對數(shù)生長期細(xì)胞，按1×105/mL接種于6孔培養(yǎng)板，分別予0、5、10和15μg/mL苦瓜蛋白，藥物作用48 h后，收集細(xì)胞，制成細(xì)胞涂片，姬姆氏染色10 min，鏡下觀察，拍照。

1.2.5 苦瓜蛋白對P-gp表達(dá)和caspase-3活性的影響：取對數(shù)生長期細(xì)胞，按1×105/mL接種于24孔板，分為對照組和苦瓜蛋白組，藥物作用48 h后，每個樣本收集細(xì)胞（2～3）×105個細(xì)胞，按試劑盒說明書進(jìn)行操作，用FACS Calibur型流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.6 苦瓜蛋白對caspase-8活性的影響：取對數(shù)生長期細(xì)胞，按1×105/mL接種于24孔板，陰性對照組加入Z-VAD-FMK 1μL/mL，對照組和苦瓜蛋白組分別加入0、5、10和15μg/mL苦瓜蛋白，每個標(biāo)本收集3×105個細(xì)胞，按試劑盒說明操作，上機(jī)檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 樣本均數(shù)比較采用軟件進(jìn)行單因素方差分析；IC50采用加權(quán)線性回歸方法計算。

2 結(jié)果

2.1 苦瓜蛋白對K562/A02細(xì)胞毒性試驗 2μg/mL以上的苦瓜蛋白即能夠顯著抑制K562/A02細(xì)胞生長（P<0.05），抑制作用隨著藥物劑量的增加而增強(qiáng)，呈明顯的劑量依賴關(guān)系（見圖1）；48 h的IC50為（20.9±0.7）μg/mL。

圖1 苦瓜蛋白抑制K562/A02增殖的作用

2.2 苦瓜蛋白誘導(dǎo)K562/A02細(xì)胞凋亡 0、5、10和15μg/mL苦瓜蛋白處理K562/A02細(xì)胞48 h，細(xì)胞凋亡率分別為（1.64±0.27）%、（4.02±0.51）%、(8.11±1.00)%和(16.36±1.47)%，(n=3)，苦瓜蛋白處理組與對照組相比較，差異有顯著性(P<0.05)，其中，以15μg/mL組細(xì)胞凋亡最明顯（見圖2）。細(xì)胞涂片姬姆氏染色，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)用藥組細(xì)胞核染色質(zhì)濃集、聚集在核膜下呈半月形或指環(huán)狀，核固縮、碎裂，凋亡小體等典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變（見圖3）。

圖2 ①對照組;②15μg/mL苦瓜蛋白處理48 h組，凋亡細(xì)胞明顯增多Anexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡（右下象限為Anexinn V陽性，PI陰性的凋亡細(xì)胞）

圖3 K562/AO2經(jīng)苦瓜蛋白處理前后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

2.3 苦瓜蛋白對P-gp表達(dá)的影響 流式細(xì)胞法檢測顯示，K562/A02細(xì)胞表面 P-gp蛋白呈高表達(dá)，表達(dá)率為（94.88±3.37）%(見圖4①)，苦瓜蛋白處理K562/A02細(xì)胞48 h后，P-gp表達(dá)下調(diào)(見表1)，以15μg/mL苦瓜蛋白組最為明顯(見圖4②)，表達(dá)率下降了30.17%。

圖4 苦瓜蛋白對K562/A02細(xì)胞P-gp表達(dá)及caspase活性的影響

2.4 苦瓜蛋白對caspase-3和caspase-8活性的影響 耐藥細(xì)胞K562/A02的caspase-3和Caspase-8活性很低，分別為(6.52±2.03)%和(9.82±1.08)%(見圖4③⑤)，經(jīng)苦瓜蛋白處理后，caspase-3和caspase-8的活性顯著增強(qiáng)（見表1），15μg/mL苦瓜蛋白組活化caspase-3和活化的caspase-8分別增至(81.91±8.87)%(見圖4④)和(26.94±2.90)%(見圖4⑥)。

表1 苦瓜蛋白對P-gp表達(dá)和caspase活性的影響（±s，n=3）

表1 苦瓜蛋白對P-gp表達(dá)和caspase活性的影響（±s，n=3）

與對照組比：*P<0.05,**P<0.01

組別(μg/mL)051 0 15 F值P-gp 94.88±3.37 87.54±2.31*81.43±3.81*74.71±4.51**14.39 caspase-3 6.52±2.03 21.79±4.34*55.52±5.96**81.91±8.87**50.15 caspase-8 9.82±1.08 14.85±1.70*17.67±1.91*26.94±2.90**19.23

3 討論

白血病細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生MDR是臨床上白血病患者化療失敗和復(fù)發(fā)的主要原因，克服白血病多藥耐藥，已經(jīng)成為白血病治療的重要課題。白血病MDR的發(fā)生均伴隨著細(xì)胞凋亡受抑的現(xiàn)象，絕大多數(shù)常規(guī)化療藥物幾乎不能誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞凋亡。苦瓜蛋白是從苦瓜中分離出來的一種植物糖苷酶，能夠使核糖體失活，抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)合成。苦瓜蛋白能顯著抑制白血病敏感細(xì)胞株K562細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡[2]，但有關(guān)苦瓜蛋白對MDR細(xì)胞的研究國內(nèi)鮮見有報道。K562/A02細(xì)胞是以P-gp蛋白升高為主要耐藥機(jī)制的細(xì)胞株，它對長春新堿、阿霉素、柔紅霉素等有不同程度的耐藥現(xiàn)象[4]，為本研究理想的實驗?zāi)Ｐ汀１狙芯勘砻?μg/mL以上苦瓜蛋白能顯著抑制耐藥白血病細(xì)胞K562/A02的增殖活性，呈明顯的劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系，苦瓜蛋白處理K562/A02細(xì)胞48 h的IC50為（20.9±0.7）μg/mL。AnnexinV/PI雙染顯示苦瓜蛋白處理后凋亡細(xì)胞顯著增加，以15μg/mL組細(xì)胞凋亡最明顯，形態(tài)學(xué)研究顯示用藥組細(xì)胞呈現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。以上提示苦瓜蛋白對常規(guī)化療藥物耐藥的K562/A02細(xì)胞保持敏感性，并能促使耐藥細(xì)胞凋亡。

白血病化學(xué)治療中藥物誘發(fā)的MDR常見、主要的機(jī)制是耐藥蛋白P-gp過度表達(dá)和細(xì)胞凋亡受抑制，對絕大多數(shù)常規(guī)藥物不敏感[5-7]。近年來的研究表明P-gp除通過從細(xì)胞內(nèi)逆濃度梯度排出抗腫瘤藥物，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，使藥物無法對白血病細(xì)胞構(gòu)成有效殺死而引起耐藥；還通過抑制caspase的激活來調(diào)節(jié)由多種因素誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，特別是依賴caspase的激活凋亡途徑[8-9]。我們的研究也證實了P-gp蛋白在K562/A02細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)，且同時存在caspase-3和caspase-8活性受抑制，提示P-gp可能通過抑制caspase的凋亡通道參與K562/A02細(xì)胞多藥耐藥性和凋亡抑制的形成。我們的研究表明，苦瓜蛋白誘導(dǎo)K562/A02細(xì)胞凋亡的過程中，存在著P-gp蛋白表達(dá)下調(diào)現(xiàn)象，15μg/mL苦瓜蛋白處理后P-gp蛋白表達(dá)率下降了30.17%；而caspase-3和caspase-8活性顯著增強(qiáng)，15μg/mL苦瓜蛋白處理后分別升高了75.39%和17.12%，因此我們認(rèn)為苦瓜蛋白能抑制P-gp表達(dá)，解除P-gp對caspase-3和caspase-8的抑制，從而逆轉(zhuǎn)因P-gp高表達(dá)對caspase的凋亡通道的抑制效應(yīng)而促進(jìn)耐藥細(xì)胞凋亡，是苦瓜蛋白誘導(dǎo)耐藥白血病細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵機(jī)制。

[1] 葉愛芳,尹麗慧,熊術(shù)道,等.苦瓜蛋白對H22細(xì)胞增殖抑制作用的實驗研究[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2008,38(4):328-332.

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