苦參堿誘導人肺鱗癌SK-MES-1細胞凋亡作用及其可能機制

金晨慈，蔣龍翔

(溫州市中西醫結合醫院 呼吸科，浙江 溫州 325000)

苦參堿（MT）是苦參根及苦豆子等中草藥的活性成分， 是苦參堿類生物堿的代表，屬于四環的噻嗪啶類，具有抗炎、免疫抑制、抗病毒、抗腫瘤等作用[1-2]。國內外研究發現MT對多種腫瘤細胞有一定的殺傷作用[3]。本研究為苦參堿對人肺鱗癌細胞株SK-MES-1增殖、細胞周期及細胞凋亡的影響， 探討其對人肺鱗癌可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 苦參堿由西安林海生物工程有限公司提供。RPMI1640、胰蛋白酶及胎牛血清為Gibco產品。四甲基偶氮唑鹽（MTT）、二甲基亞砜（DM-SO）、牛血清白蛋白（BSA）均為Sigma公司產品。Bcl-2、bax和caspase-3多克隆抗體購自cellsignal公司。

1.2 細胞培養 人肺鱗癌細胞株SK-MES-1購自中科院細胞庫，常規培養于含10%新生牛血清的RPMI1640培養液中，置于37 ℃，5% CO2培養箱內傳代培養，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.3 MTT法檢測苦參堿對SK-MES-1細胞增殖的影響 取對數生長期的SK-MES-1細胞，消化后重懸，以5×107/L的密度接種到96孔培養板，每孔加100μL細胞懸液。實驗設對照組、不同濃度藥物組細胞，貼壁后加入不同濃度苦參堿20μL，使其終濃度分別為0、7.5、15、30、60、120、240 mg/L。每組設6個復孔。加入藥物后，分別培養24、48、72 h，每孔加入MTT液（5 g/L）10μL，培養4 h后，吸去培養液，每孔加入150μL DM-So，置酶標儀570 nm波長處，測吸光度值，并按下列公式計算細胞增殖抑制率: 細胞增殖抑制(%)=(1-處理組OD570值/空白對照組OD570值)×100%。實驗重復3次。

1.4 流式細胞儀檢測苦參堿對SK-MES-1細胞凋亡率的影響 取對數生長的細胞以每瓶2×106的密度接種于培養瓶中，細胞貼壁后，棄上清。加入不同濃度苦參堿20μL，使其終濃度分別為0、7.5、15、30、60、120、240 mg/L。孵育48 h后用0.25%胰酶收集所有細胞，用70%乙醇于4 ℃固定30 min，PBS沖洗殘留乙醇兩次，加入150μL RNase（5 g/L）和150μL PI溶液（50μg/mL）于室溫避光染色30 min后，進行流式細胞儀檢測，計算細胞凋亡率。

1.5 流式細胞儀檢測苦參堿對SK-MES-1細胞周期的影響 取對數生長的細胞以每瓶2×106的密度接種于培養瓶中。24 h后加入不同濃度苦參堿20μL，使其終濃度分別為0、7.5、15、30、60、120、240 mg/L。37 ℃孵育48 h后用胰酶消化成單細胞懸液，PBS沖洗兩次，加入10μL PI溶液（20μg/mL）和5μL Annexin V混勻，予室溫避光染色15 min后，流式細胞儀檢測細胞周期DNA含量分析，確定細胞周期分布。

1.6 染色流式細胞儀檢測Bcl-2，bax，caspase-3表達 取對數生長的細胞以每瓶2×106的密度接種于培養瓶中，細胞貼壁后，棄上清。加入不同濃度苦參堿20μL，使其終濃度分別為0、7.5、15、30、60、120、240 mg/L。37 ℃孵育 48 h后收集至10 mL離心管中，PBS洗滌兩次。將每管細胞濃度調至（0.5～1）×106/mL。加入4%多聚甲醛，室溫固定10 min；加入預冷的90%甲醇（900μL+100μL BSA）破膜；加入一抗室溫放置1 h；然后加入FITC標記二抗2μL孵育30 min（避光）。將細胞懸液移入12 mm×75 mm的試管內，以流式細胞儀測FITC的熒光強度。

1.7 統計學處理方法 采用方差分析。

2 結果

2.1 MT對SK-MES-1細胞增殖的抑制作用 MTT法檢測結果表明：與對照組相比，苦參堿能顯著抑制SK-MES-1細胞的增殖， 并有明顯的劑量效應及時間效應關系（見圖1）。

圖1 SK-MES-1細胞在苦參堿作用下的量效曲線

2.2 MT對SK-MES-1細胞凋亡及細胞周期的影響流式細胞儀檢測結果顯示：與對照組相比，苦參堿處理后的SK-MES-1細胞凋亡率增加，并與給藥濃度成正比。并且SK-MES-1細胞在G0/G1期的比例增高，在S期的比例降低，并有劑量依賴性（見表1）。

表1 不同濃度苦參堿作用SK-MES-1細胞凋亡率和周期時相分布（%）

表2 SK-MES-1細胞相關凋亡蛋白Bcl-2、bax、caspase-3表達比較（熒光強度）

2.3 MT對SK-MES-1細胞蛋白表達的影響 流式細胞儀檢測結果表明：與對照組相比，苦參堿處理后的SK-MES-1細胞bax和capase-3表達增強，Bcl-2表達下調，并有劑量依賴性（見表2）。

3 討論

肺癌是全球范圍內發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，其病理類型中又以鱗狀上皮細胞癌最常見，約占原發性肺癌的40%～50%。肺癌的治療是多學科綜合的治療(主要包括外科切除、放射治療、化學治療)[4]。目前的常規化療藥物盡管其抑制或殺傷腫瘤細胞的作用肯定，但其毒副作用及多藥耐藥性難以克服。隨著中醫對肺癌認識的深入，中醫藥在改善肺癌患者癥狀、提高患者生存質量、延長生存期及配合西醫增效減毒等方面的優勢得到了認同[5]。

苦參堿具有多種生物活性，對于胃癌[6]、白血病[7]、宮頸癌[8]和肝癌[9]等多種腫瘤細胞具有抑制作用。近年來研究表明：①苦參堿可誘導細胞發生凋亡，其作用效果與濃度呈正相關。苦參堿促使腫瘤細胞凋亡的原因可能是苦參堿影響了腫瘤相關基因的表達[10]。②苦參堿抑制腫瘤細胞增殖和誘導分化，可使細胞發生S期阻滯。這可能與端粒酶、細胞周期蛋白、增殖相關基因有關。③抗腫瘤細胞黏附與浸潤轉移[3]。在臨床上，代志軍等[11]等研究發現，苦參堿能提高中晚期肺鱗癌化療患者的免疫功能，減輕化療的毒副作用。

本研究發現，不同濃度苦參堿(7.5、15、30、60、120、240 mg/L)對人肺鱗癌細胞株SK-MES-1有不同程度的增殖抑制作用，且隨著作用濃度的增高和作用時間的延長，細胞增殖受抑更為明顯，提示苦參堿對SK-MES-1細胞的增殖有抑制作用，并有一定的劑量效應及時間效應關系。通過流式細胞分析發現，7.5、15、30、60、120、240 mg/L苦參堿作用48 h后，可使G0/G1期細胞比例較對照組增多且比例逐漸升高，G2/S期細胞比例減少，存在G0/G1期阻滯。通過以上研究結果， 我們推測：苦參堿可以影響腫瘤細胞內DNA的復制和合成，抑制細胞的正常分裂；抑制細胞進入S期，從而使細胞在G1期堆積，出現G2/M阻滯，阻止細胞進行有絲分裂，從而抑制細胞的增殖。

本研究發現：與對照組相比，苦參堿處理后的SK-MES-1細胞凋亡率增加。Bcl-2是細胞的抗凋亡因子，有穩定線粒體膜，阻止線粒體釋放caspase，阻遏氧自由基誘導凋亡信號通路的作用[12]。通常情況下，Bcl-2與促凋亡基因bax結合，以二聚體的形式存在[13]。當Bcl-2減少和bax增加時，細胞易于凋亡，反之細胞免遭凋亡。caspase-3是引起細胞凋亡的具體執行酶，是細胞凋亡的主要效應因子[14]。本研究觀察MT可以促進SK-MES-1細胞的bax和capase-3表達，抑制Bcl-2表達，從而說明MT可能通過抑制Bcl-2和激活bax，減少細胞色素C的釋放，激活caspase-3進而激活caspase蛋白酶家族，誘導細胞凋亡的發生。然而細胞凋亡是一個多因素參與的復雜過程，其具體機制還需進一步研究。

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