小動物腦功能磁共振成像研究進展

臧鳳超，張洪英,2 綜述，滕皋軍* 審校

血氧水平依賴的功能磁共振成像(blood oxygen level dependent functional magnetic resonance imaging,BOLD-fMRI)是一種無創性的探索腦神經活動機制的方法，在人體已經進行了大量研究，包括對認知活動、靜息狀態、視覺、運動、神經精神疾病等方面的腦fMRI研究已經取得一系列的發現和成果，動物fMRI研究則可以實現由于倫理因素在人體不能進行的基礎研究，探索生理、病理狀況下內在的腦功能機制。BOLD信號的神經基礎就是在1990年最早由Ogawa等[1]利用超高場磁共振(7.0 T和8.4 T)對大鼠腦進行研究時發現的。嚙齒動物最常用于小動物功能磁共振成像研究。小動物fMRI可以適用于不宜在人腦進行的研究，開拓了神經科學的新領域，使我們能更好地理解腦功能活動的生理和分子機制。

1 小動物fMRI的研究條件

幾乎絕大多數的實驗動物是在麻醉條件下進行的，常用的麻醉劑有α-氯醛糖、異氟烷和烏拉坦等。研究發現實施全麻會對神經活動和BOLD fMRI信號強度產生影響[2]：麻醉劑抑制腦的激活、代謝及血流動力；尤其是腦區間的功能連接性與麻醉深度有關，當麻醉深度較大時，兩側軀體感覺腦區間的靜息fMRI功能連接性消失[3]。α-氯醛糖、烏拉坦等麻醉劑具有一定的毒性，不能用于縱向研究；近來的研究發現應用美托咪定，實現了鎮靜狀態的fMRI研究，以便模擬近似清醒狀態[4,5]。美托咪定是β2腎上腺素能受體激動劑，具有鎮定、去焦慮和一些止痛、肌松方面的藥理作用，它的作用安全，可以適用于縱向研究。少數fMRI研究將大鼠、兔等動物經過適應性訓練，在清醒的狀態下進行成像檢查[6]。清醒狀態動物的fMRI避免了麻醉對腦血流、腦代謝、神經血管反應的影響和混淆因素，可以進行腦皮層高級認知活動的研究，但是面對的困難是要克服動物的頭部運動干擾及緩解動物在掃描環境中的緊張，為此，一種專用的大鼠固定裝置被設計制造出來。清醒狀態的動物在fMRI實驗過程也需要注射適量的地西泮等鎮定劑來消除動物的緊張反應。

進行小動物的fMRI研究需要超高場磁共振設備，因為小動物的腦體積小，需要小孔徑的高場磁體和相應的配套小線圈，以便得到良好的、敏感的信號和信噪比。BOLD信號不僅依賴于氧合血紅蛋白，還受到血氧、血流速度、血容量等因素的影響；動物fMRI檢查過程還需要對體溫、呼吸、血氧飽和度、二氧化碳分壓等進行監測，以控制這些因素對血流動力學變化和血氧代謝的影響。

2 小動物fMRI腦激活的研究

由于動物難以配合進行認知方面的腦功能成像，目前的動物fMRI研究多集中在BOLD機制、感覺運動系統、神經疾病模型及藥物等方面的研究。

大鼠的腦功能刺激實驗多采用組塊設計。BOLD信號是與腦皮層活動相關的，電極刺激大鼠前后爪的方法已經廣泛用來研究BOLD信號在軀體感覺通路，特別是感覺皮層的激活模式，這些研究結果一致地顯示了刺激單側前爪引起對側第一軀體感覺皮層(SⅠ)的激活，激活區BOLD信號增高2.1%左右[5]；研究也發現前爪的感覺代表區位置位于后爪的代表區前方和外側方[7]；但是對感覺傳導通路的激活效果研究結果不一致，Keilholz等[8]利用電刺激大鼠前爪顯示了小腦皮層、丘腦、SⅠ及SⅡ(第二軀體感覺皮層)的激活，而其他一些類似研究未能發現感覺傳導路徑的激活[5,7]，可能與實驗設計有關。BOLD信號與電刺激強度之間的關系也有不同的研究結果，多數的研究認為電流1～2 mA、3～8 Hz低頻率的電刺激強度引起感覺皮層的最大激活，但是Goloshevsky等[9]的研究發現BOLD信號隨著電刺激頻率的增加(至180 Hz)而增加。研究也證明刺激前爪誘發的感覺皮層的BOLD信號和體感誘發電位(SEP)的變化呈相關性。

對大鼠的痛覺的皮層及傳導通路的研究則發現兩側感覺運動皮層、扣帶回、丘腦后外側核、島葉及海馬等腦區接受刺激時呈固定激活[10]。

以小動物fMRI為工具可以用來研究大鼠腦梗死后腦功能的重塑變化，例如Dijkhuizen等[11]刺激偏癱肢體發現，卒中后早期病灶對側大腦半球廣泛的激活增強為主，而兩周后(中期)表現為病灶周圍激活增強，這種梗死后雙期的腦功能變化機制為卒中的治療和康復提供了理論。

3 腦激活的生理和藥理研究

在腦激活的過程中血流動力學反應與腦激活關系之間存在復雜的分子機制，通過阻斷某些分子通道，觀察對BOLD信號的影響，能研究分子通道作用和血流動力學間的關系，嚙齒動物和高場磁共振成為研究BOLD機制的重要手段。目前主流觀點認為膠質細胞是神經元興奮和血流BOLD信號間的中介，通過谷氨酸鹽、Ca2+、NO等信號途徑調節腦組織微血管舒縮及血氧水平[12-14]。

fMRI可以評估藥物作用引起的腦活動變化，已經成為一種藥理學研究的工具，被稱為藥理學fMRI (pharmacologic fMRI，phfMRI)。盡管神經藥物可能引起心血管、呼吸作用進而影響fMRI，小動物phfMRI正越來越多地被用于揭示藥物在神經系統的藥理作用，例如觀察戊四唑引起的鼠腦癲癇放電腦區的活動[15]；Shah等[16]利用phfMRI成像探索大鼠腦神經遞質分布圖，注射嗎啡后使阿片受體密集的腦區激活及然后注射其拮抗劑納洛酮，發現嗎啡引起扣帶回、丘腦、下丘腦、杏仁核、導水管周圍灰質正性激活，并且可以被納洛酮阻斷，激活減退。phfMRI的設計一般不用傳統的組塊式設計，而是用兩階段式的基線/藥物注射比較。

4 靜息腦功能的研究

靜息fMRI指的是受試者放松、靜止不動，并避免任何有意思維活動的狀態下進行功能磁共振成像。靜息態fMRI數據中包含的低頻BOLD信號波動(low frequency fluctuation，LFF)，反應了中樞神經靜息情況下自發的神經活動(頻率范圍0.01～0.1 Hz)，人類的靜息fMRI研究發現靜息狀態存在默認網絡，呈現較強的興奮活動。目前認為靜息功能網絡可能是神經認知網絡活動的重要基礎和來源，對于靜息狀態大腦活動的研究有利于全面認識大腦的內在活動機制。動物的靜息fMRI不能模擬人的靜息狀態，只有在麻醉下進行，多數麻醉方法對BOLD信號產生不利影響，近年來少數研究開始用美托咪定為鎮定劑進行淺麻醉，以便獲得強的BOLD信號和功能連接性。小動物的fMRI為揭示LFF信號的本質提供了平臺。Pelled等[17]對活體鼠腦和死亡后的鼠腦進行的LFF信號比較研究表明，LFF是一種生理性的信號。研究已經發現大鼠兩側大腦對稱的功能腦區如感覺運動皮層、基底節等存在一致的LFF信號網絡[4,18]，研究認為小型哺乳動物BOLD信號中的LFF也適用于探索動物腦功能圖。Pawela等[18]研究以大鼠丘腦后區為種子區利用時程相關方法檢測到由兩側第一、第二運動區、扣帶回及同側第二感覺皮層區構成的感覺運動功能網絡，而且還發現了由視皮層V1區、背外側膝狀體核、上丘構成的視覺信號網絡。尚未見到小動物的腦內默認網絡報道。

5 非BOLD功能磁共振成像技術的研究

BOLD信號所反應的是神經活動相伴隨的血流動力學變化，并不能直接探測神經元的激活過程。由于血管系統的變化，以及神經活動與血液動力學之間耦合的復雜性，BOLD功能磁共振技術無法對神經元活動進行精確的空間和時間定位。為了克服這些問題，研究者們一直在努力發展直接探測神經元活動的非BOLD功能磁共振技術。這些技術包括神經電流磁共振成像(neuronal current MRI，ncMRI)，擴散加權功能磁共振成像(diffusion-weighted fMRI)，以及分子功能磁共振成像(molecular fMRI)[19]。

小動物被廣泛應用于非BOLD功能磁共振成像技術的發展與可行性研究之中。最近，Luo等[20]利用離體但完整的烏龜腦系統(包含眼睛)進行ncMRI技術的可行性研究。當把帶著眼睛的龜腦從顱骨中取出并放置于人工腦脊液中時，龜腦仍然能夠產生正常的視覺誘發神經活動。因此，該龜腦系統提供了一個完全沒有血液但卻能夠響應自然生理刺激(視覺)的動物模型。利用這個模型，可以在沒有任何BOLD效應干擾的情況下探測ncMRI信號。除了神經電流成像實驗，在擴散加權和分子功能磁共振技術研究中也使用了小動物模型。例如Jin等[21]在貓的大腦中探測視覺刺激引起的擴散加權磁共振信號變化，Lin等[22]利用大鼠進行以錳離子作為對比劑的分子功能磁共振成像實驗。這些基于小動物的實驗為非BOLD技術的發展作出了巨大的貢獻。

總之，小動物的腦功能成像研究已成為影像醫學與生理、藥理、精神神經等基礎學科的交匯點，在基礎醫學的研究中得到越來越多的應用，將來會有更多的研究成果。

致謝：本文撰寫得到了美國芝加哥大學Jiahong Gao博士的指導。

[1]Ogawa S, Lee TM, Kay AR, et al. Brain magnetic resonance imaging with contrast dependent on blood oxygenation. Proc Natl Acad Sci U S A, 1990,87(24):9868-9872.

[2]Hudetz AG, Wood JD, Kampine JP. Cholinergic reversal of isoflurane anesthesia in rats as measured by crossapproximate entropy of the electroencephalogram.Anesthesiology, 2003,99(5):1125-1131.

[3]Lu H, Zuo Y, Gu H, et al. Synchronized delta oscillations correlate with the resting-state functional MRI signal. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007,104(46):18265-18269.

[4]Zhao F, Zhao T, Zhou L, et al. BOLD study of stimulationinduced neural activity and resting-state connectivity in medetomidine-sedated rat. Neuroimage, 2008,39(1):248-260.

[5]Weber R, Ramos-Cabrer P, Wiedermann D, et al. A fully noninvasive and robust experimental protocol for longitudinal fMRI studies in the rat. Neuroimage,2006,29(4):1303-1310.

[6]Duong TQ. Cerebral blood flow and BOLD fMRI responses to hypoxia in awake and anesthetized rats. Brain Res, 2007,1135(1):186-194.

[7]Bock C, Krep H, Brinker G, et al. Brainmapping of alphachloralose anesthetized rats with T2*-weighted imaging:distinction between the representation of the forepaw and hindpaw in the somatosensory cortex. NMR Biomed,1998,11(3):115-119.

[8]Keilholz SD, Silva AC, Raman M, et al. Functional MRI of the rodent somatosensory pathway using multislice echo planar imaging. Magn Reson Med, 2004,52(1):89-99.

[9]Goloshevsky AG, Silva AC, Dodd SJ, et al. BOLD fMRI and somatosensory evoked potentials are well correlated over a broad range of frequency content of somatosensory stimulation of the rat forepaw. Brain Res, 2008,1195(2):67-76.

[10]Shih YY, Chang C, Chen JC, et al. BOLD fMRI mapping of brain responses to nociceptive stimuli in rats under ketamine anesthesia. Med Eng Phys, 2008,30(8):953-958.

[11]Dijkhuizen RM, Ren J, Mandeville JB, et al. Functional magnetic resonance imaging of reorganization in rat brain after stroke. Proc Natl Acad Sci U S A,2001,98(22):12766-12771.

[12]Peppiatt CM, Howarth C, Mobbs P, et al. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature,2006,443(7112):700-704.

[13]Van der Linden A, Van Camp N, Ramos-Cabrer P, et al. Current status of functional MRI on small animals:application to physiology, pathophysiology, and cognition.NMR Biomed, 2007,20(5):522-545.

[14]Hall CN, Attwell D. Neuroscience: Brain power. Nature,2008,456(7223):715-716.

[15]Keogh BP, Cordes D, Stanberry L, et al. BOLD-fMRI of PTZ-induced seizures in rats. Epilepsy Res, 2005,66(1-3):75-90.

[16]Shah YB, Haynes L, Prior MJ, et al. Functional magnetic resonance imaging studies of opioid receptor-mediated modulation of noxious-evoked BOLD contrast in rats.Psychopharmacology (Berl), 2005,180(4):761-773.

[17]Pelled G, Goelman G. Different physiological MRI noise between cortical layers. Magn Reson Med,2004,52(4):913-916.

[18]Pawela CP, Biswal BB, Cho YR, et al. Resting-state functional connectivity of the rat brain. Magn Reson Med,2008,59(5):1021-1029.

[19]Jasanoff A. Bloodless fMRI. Trends Neurosci, 2007,30(11):603-610.

[20]Luo Q, Lu H, Lu H, Senseman D, Worsley K, Yang Y,Gao J-H. Physiologically evoked neuronal current MRI in a bloodless turtle brain: detectable or not? NeuroImage,2009, 47(4):1268-1276.

[21]Jin T, Zhao F, Kim SG. Sources of functional apparent diffusion coefficient changes investigated by diffusionweighted spin-echo fMRI. Magn Reson Med, 2006,56(6):1283-92.

[22]Lin YJ, Koretsky AP. Manganese ion enhances T1-weighted MRI during brain activation: an approach to direct imaging of brain function. Magn Reson Med, 1997,38(3):378-88.