鉀通道 Kv1.2與致癇大鼠發病相關性的研究

曾常茜, 李冬平, 唐 偉, 王 葳, 曹平安, 鄒颯楓

癲癇是一組由多種病因引起的以腦部神經元過度放電所致的突然、反復和短暫的中樞神經系統功能失常為特征的慢性臨床綜合征。現已證明大多數遺傳性特發性癲癇與離子通道基因突變有關。鉀通道在調節神經元的興奮性方面起著重要的作用,其主要功能是促進細胞膜盡快恢復靜息狀態,控制細胞的興奮性水平和放電頻率。鉀通道 Kv1.2是瞬時外向鉀通道,其特點是去極化時通道暫時開放,產生短暫外向電流即 IA電流。IA電流是動作電位復極化早期外向電流的主要成分,當 A型鉀通道異常失活時,常導致動作電位長時程延長。鉀通道 Kv1.2與癲癇發病機制的關系是近年來的研究熱點。本實驗通過檢測戊四唑致癇大鼠海馬區鉀通道 Kv1.2蛋白表達,探討鉀通道Kv1.2與癲癇發病機制的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料 SD雄性大鼠 40只(10周齡、體重220±20克)由大連醫科大學實驗動物中心提供。兔抗鼠 Kv1.2單克隆抗體購自alomone公司,β-actin內參蛋白購自上海碩盟,生物素標記的羊抗兔 IgG抗體、SP試劑和 DAB顯色劑購自北京中杉金橋公司;Marker購自 Cell Signaling Technology公司;戊四唑 (PTZ)購自 Sigma公司;NP-40、SDS、PMSF、BSA、丙烯酰胺、Tris堿 、TEMED、過硫酸胺、澳酚藍 、甘氨酸、DTT、考馬斯亮藍 R-250,均為 Amresco公司產品。POWERLAB電生理記錄儀(ADinstruments/澳大利亞);DU640紫外分光光度計(BECKMAN);蛋白電轉儀、垂直電泳儀和凝膠成像系統(Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1 癲癇模型的制作 SD雄性大鼠 40只分成實驗組 30只,對照組 10只。對 30只實驗組大鼠,首先給予大鼠腹腔注射 1%PTZ溶液 40mg/kg,10min后注射 20mg/kg,然后每 10min注射 10mg/kg。大鼠驚厥的行為表現采用 Racine 6級評價標準:0級,無任何反應;I級,濕狗樣抖動、面肌痙攣如眨眼、動須及節律性咀嚼;Ⅱ級,頸部肌肉痙攣,表現為點頭和(或)甩尾;Ⅲ級,一側前肢陣攣;Ⅳ級,雙側前肢陣攣伴站立;V級,全身陣攣,失去平衡,跌倒。當大鼠達 4～5級、重復的驚厥發作達10min以上以及腦電監測為尖波、慢波、尖慢復合波時認定大鼠致癇成功,分別在 1h、24h、48h時間段取材進行以下實驗。

1.2.2 腦電的引導與分析 從實驗組中隨機抽取 6只、從對照組中隨意抽取 2只大鼠行腦電監測。電極安裝在右額及右枕(右額坐標為:前囟前3.0mm,中線旁 2.0mm,硬膜下 0.5mm;右枕坐標為:前囟后 5.8mm,中線旁 3.0mm,硬膜下 0.5mm)。通過 powerlab生理記錄儀進行腦電記錄,參數:高通0.03s,低通 30Hz,量程 500μv～3mv。在注射前后監測 EEG,每 5min記錄一次至 150min。通過對腦電圖的形態、頻率、波幅進行癇樣放電的判斷。

1.2.3 分組 實驗組共 30只,成功致癇后在1h、24h、48h時間段各取 8只大鼠腦組織行電壓門控鉀通道 Kv1.2檢測。對照組共 10只,隨機抽取 8只正常大鼠腦組織行電壓門控鉀通道 Kv1.2檢測。

1.2.4 腦片制作及組織凍存 大鼠在 10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔麻醉下,經左心室灌注生理鹽水 150ml,隨后灌注含 4%多聚甲醛 0.1mol/L PB(p H7.4,4℃)300ml。取出大腦,將腦組織分成兩半。一半用 4%多聚甲醛固定 24h,4℃。常規脫水、透明、石蠟包埋。約位于海馬區層面連續冠狀切片,厚 3μm,每隔 5片取 2片,行免疫組化染色。另一半分離出海馬并迅速放置于液氮罐中低溫保存,以備行 Western Blot檢測。

1.2.5 免疫組化染色檢測鉀通道 Kv1.2的表達 鉀通道 Kv1.2抗原表達檢測采用 ABC染色方法:各組大鼠做石蠟切片后常規脫蠟,微波修復抗原,自然涼至室溫。抑制內源性過氧化物酶活性后,用山羊免疫正常血清封閉非特異性結合位點,室溫孵育 30min。加兔抗鼠 Kv1.2單克隆抗體 (1∶200),4℃過夜。PBS洗滌,5min×3次。加生物素標記的羊抗兔 IgG抗體,37℃1h后,PBS洗滌,5min×3次。滴加 SP試劑,室溫作用 20min,PBS洗滌,5mim×3次。加 DAB顯色 2min后,用蘇木精復染1min。脫水、透明,中性樹膠封片。顯微鏡下(×400)觀察結果。用 Image pro plus圖像分析軟件測定海馬 CA1、CA3、齒狀回(DG)Kv1.2蛋白表達的平均光密度(IOD/area),并進行統計分析。

1.2.6 Western Blot檢測鉀通道 Kv1.2蛋白水平用 RIPA裂解液提取腦組織全細胞蛋白、紫外光分光光度計測定蛋白濃度及計算上樣量;在 100℃水浴中煮5 min使蛋白充分變性;用蛋白垂直電泳儀進行 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白;利用蛋白電轉儀裝置進行轉膜;NC膜放入封閉液中 4°C過夜;在 NC膜上均勻加入抗鼠 Kv1.2單克隆抗體(1∶200),37℃孵育 1h,用TTBS洗去未結合的一抗;在 NC膜上均勻滴入生物素標記的羊抗兔 IgG抗體,37℃孵育 1h,TTBS洗 3×10min;加入辣根酶標記的鏈霉親和素工作液,37℃孵育1h,TTBS洗 3×10min;滴加 DAB液,避光顯色。用Lannch Doc-Itis軟件對圖片條帶行光密度測定,取各條帶累積光密度(IOD)與相對應的 β-actin內參蛋白 IOD之比,即 Kv1.2蛋白的相對量作統計分析。

1.3 統計學方法 用 SSPS 11.5軟件對免疫組化檢測電壓門控鉀通道 Kv1.2蛋白表達的平均光密度進行方差分析和 LSD檢驗。Kv1.2蛋白表達的IOD與 β-actin蛋白的 IOD比值作為蛋白表達相對量,對此進行方差分析和 LSD檢驗。

2 結 果

2.1 癇樣行為及腦電圖檢測結果 實驗組 30只大鼠均于 2次注射 PTZ 20mg/kg后出現抖動、動須、點頭及節律性咀嚼,然后每 10min注射 10mg/kg 1～2次后,27只大鼠出現全身陣攣、角弓反張、四肢強直、跌倒,達到 Racine標準 4～5級,持續約 10～20min后逐漸停止抽搐。在大鼠抽搐發作中,腦電圖明顯異常,表現為大量的高尖波及尖慢復合波,節律不規則,平均波幅 120μV最大波幅達 260μV,頻率達 30Hz。隨著大鼠抽搐的停止,高尖波及尖慢波逐漸減少,波幅下降,直至停止監測仍有散在尖波。另外 3只大鼠均無全身痙攣出現,未達到 Racine標準 4～5級,剔除出實驗組。對照組大鼠腦電圖呈細小 α波,波幅較均一,最大波幅 ＜10,頻率 8Hz(見圖1)。

圖1 實驗組與對照組大鼠腦電圖檢測結果

2.2 大鼠 Kv1.2蛋白表達結果 Kv1.2蛋白在對照組和實驗組大鼠海馬均有分布,以錐體細胞層、齒狀回顆粒細胞層為主。高倍鏡下可見陽性細胞一般為梭形或星形,胞漿及細胞膜上有棕黃色陽性反應顆粒,以 CA3區最為明顯。各時間段(1h、24h、48h)的實驗組大鼠海馬陽性細胞數均較對照組少,陽性細胞著色較淺,少有突起,未見明顯膠質細胞增生。各時間段(1h、24h、48h)的實驗組大鼠海馬 CA1、CA3、DG區的平均光密度值均較對照組顯著減少(P＜0.05);實驗組 3個時間段(1h、24h、48h)的各海馬區平均光密度值無顯著性差異(P＞0.05)(見表1)(見圖2～圖4)。

2.3 大鼠 Kv1.2蛋白相對濃度的檢測結果在 57kd處有明顯的蛋白條帶。對照組與各實驗組相比蛋白條帶明顯寬厚,而各實驗組蛋白條帶之間基本相同。42kd處內參蛋白條帶在對照組與各實驗組之間基本相同。結果提示,海馬神經元有 Kv 1.2表達,實驗組大鼠海馬區 Kv1.2表達下降,這與免疫組化染色檢測的結果一致。致癇后 1h、24h、48h大鼠海馬區 Kv1.2蛋白相對濃度與對照組相對濃度均有明顯差異(P＜0.01)(見表2)。

表1 免疫組化法檢測 Kv1.2蛋白表達結果

表2 Western blot檢測大鼠海馬 Kv1.2蛋白結果

3 討 論

癲癇的功能失常可表現為運動、感覺、意識、行為、自主神經功能等不同障礙。神經元靜息電位的維持,動作電位的發生、發展均與鉀離子在細胞內外正常分布密切相關。當鉀離子分布發生異常改變時,常伴發腦電生理中陣發性去極化飄移,神經元出現異常電生理活動。在動物癲癇和癲癇性發作模型中,發現在發作前或發作中細胞外鉀離子濃度均有升高。鉀離子分布主要通過鉀離子通道途徑來調節,鉀通道開放時促進 K+外流,引起細胞膜復極化和超極化,從而降低細胞的興奮性。因此鉀離子通道功能的改變是引起神經元內在興奮性不平衡的物質基礎,癲癇的發病機制與電壓門控鉀離子通道密切相關。

神經元的活動、信息傳遞無不通過動作電位來完成,動作電位發放的調節主要是通過電壓門控鉀離子通道外向電流來實現。在神經細胞從超極化向去極化閾電位過度時首先受到電壓門控鉀通道 Kir2抑制性調節,隨著電位向閾電位的上升,Kir2鉀通道逐漸失活關閉[1,2]。當電壓接近 -60mV時另一電壓門控鉀通道被激活,對神經細胞和神經突觸的去極化進行抑制調節作用。這種鉀通道在低于閾電位時開始被激活,Bekkers等[3]對此類通道進行分子結構及門控特性的研究,認定其為 Kv1型鉀通道。與神經細胞異常放電密切相關的癲癇是否會因 Kv1通道功能異常引發很值得探討。

戊四唑能引起動物抽搐迅速發生,短時間內達到高峰,持續較短時間后自動停止,因此戊四唑被認為是復制急性全身強直陣攣發作癲癇模型的理想藥物。本實驗通過對大鼠腹腔注射戊四唑建立了癲癇的急性全身強直陣攣發作癲癇模型,在此模型上對 3組不同時間致癇大鼠海馬 CA1、CA3、DG區鉀通道 Kv1.2進行檢測并與對照組大鼠比較,結果表明:致癇組大鼠海馬區鉀通道 Kv1.2蛋白表達水平在致癇后 3個時間段(1h、24h、48h)均明顯低于對照組(P＜0.05)。各致癇組大鼠海馬區鉀通道 Kv1.2蛋白表達水平在致癇后3個時間段(1h、24h、48h)之間均無明顯差異(P＞0.05)。因此認為大鼠海馬區鉀通道 Kv1.2表達的減少與全身強直陣攣發作大鼠癲癇發病密切相關。這與 Tsaur[4]在實驗中檢測到致癇鼠海馬區 Kv1.2 mRNAs表達明顯減少相一致。而致癇大鼠在 48h之內鉀通道 Kv1.2的表達并無明顯差異,推測在此時間段神經元內鉀通道蛋白合成仍未完全恢復。在實驗組和對照組大鼠海馬區均可見陽性細胞表達,主要集中于海馬顆粒細胞層,顆粒細胞層細胞異常放電可能是大鼠癲癇發作的主要因素。這與 Park等[5]實驗發現戊四唑致癇鼠 Kv1.2免疫反應異常增強主要位于海馬顆粒細胞層的結果相一致。

電壓門控鉀通道亞家族 Shaker(Kv1.1-Kv1.8)為四聚體通道,由 Kcna1-Kcna 8基因編碼,其中編碼Kv1.1、Kv 1.2的基因具有最高同源性。 Kv1.1、Kv1.2兩通道的四聚體構成基本相同,因此功能上也表現為很多的相同性。這兩種鉀通道共同表達于神經細胞內,通過該通道的鉀離子形成一瞬時外向性鉀電流即 A-型鉀電流(IA)。這種鉀通道在低于閾電位時開始被激活,產生外向 IA并抵消刺激電流,去極化幾乎被抑制,延長,膜電位去極化。動作電位的時程決定功能依賴性鈣的進入并調節鈣依賴的后續進程,增加 Ca2+內流入神經末端,觸發神經遞質大量釋放并介導興奮性突觸后電位,增強神經元興奮性。因此 A通道作為一個阻尼器,在動作電位之間插入一個間歇時間,動作電位峰峰間隔延長,使重復爆發性放電變成緩慢放電,調節神經細胞的復極化,降低膜的興奮性。有外國學者 Shen[6]等對此類鉀通道進行分子結構及門控特性的研究時發現,雖然 Kv1.1、Kv1.2和 Kv1.6 mRNA在神經細胞內均有表達,但藥理學上表明此類通道主要是由 Kv1.2構成。在閾下鉀電流中通過 Kv1.2的鉀電流占有近一半。因此作者認為 Kv1.1,Kv1.2雖均參于復極化電位調節,但 Kv1.2是影響鋒電位閾值以及重復放電的主要機制,因而鉀通道 Kv1.2表達的減少必然增強神經細胞的興奮性并引發癲癇。鉀通道 Kv1.2由 α核心亞基及 β輔助亞基組成,除了其核心亞基表達減少可引起癲癇外,Connor[7]發現刪除編碼 β輔助亞基基因同樣可引發大鼠抽搐。通過本實驗我們更深一步地認識到電壓門控鉀通道 Kv1.2功能的異常是全身強直陣攣發作癲癇的重要發病機制,這為開發新的治療癲癇藥物-鉀通道 Kv1.2開放劑,提供了進一步的理論基礎和實驗依據。

圖2 大鼠海馬齒狀回 Kv 1.2的表達(免疫組化法,40×)

圖3 大鼠海馬CA 1區 Kv1.2的表達(免疫組化法,200×)

圖4 大鼠海馬 CA 3區 Kv1.2的表達(免疫組化法,400×)

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