阿托伐他汀對腦缺血大鼠認知功能的影響

劉福中, 龍建庭, 朱云龍, 游 詠

隨著人口老年化,血管性癡呆(Vascular Dementia,VD)的發病率日益增高。據 WHO統計,在歐美等發達國家,血管性癡呆占全部癡呆的 10%～20%,而我國的一些研究資料顯示,血管性癡呆約占全部癡呆的 60%左右,這可能與資料的人口構成、診斷方法和剔除標準的不同有關,但在一定程度上提示血管性癡呆是我國老年性癡呆的主要組成部分,也是目前老年期癡呆中可預防和有希望治療的癡呆之一。他汀類藥物是作為降脂藥物被研發的,但在臨床實踐中發現它們還有許多降脂以外的作用,如拮抗動脈粥樣硬化、預防心腦血管事件、癡呆和骨質疏松等[1]。大規模的臨床研究表明,使用他汀對預防血管性癡呆和改善認知功能有益[2,3],其具體機制不祥。本研究通過觀察阿托伐他汀對 SD大鼠學習記憶能力及其對海馬超微結構的影響,以探討阿托伐他汀對血管性性癡呆大鼠的保護作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 實驗動物選用雄性 SD大鼠30只,鼠齡 3～ 4月,體重(252.6±24.5)g,均由南華大學動物部提供,許可證號為 SCXK(湘)2005-0010。全部大鼠在正常溫控、自然光照及自由攝食條件下飼養。30只大鼠隨機分為 3組:假手術組(10只 ),模型組 (10只),治療組(10只 )。

1.2 模型制作及給藥方法 采用雙側頸總動脈永久結扎法[4]:用 6%的水合氯醛(5ml/kg)麻醉大鼠;成功后仰臥固定在手術臺上,常規消毒,頸正中切口,分離雙側頸總動脈,4號絲線雙重結扎;術中大鼠體溫保持在 36.5℃;縫合切口,放回籠中飼養。術后加強護理,可以有效避免大鼠死亡。假手術組大鼠只分離不結扎頸總動脈,其余操作過程同模型組。模型建立后1w開始,治療組給予阿托伐他汀 5mg·kg-1·d-1(1ml)藥物。由輝瑞公司生產,規格為:20mg/片(立普妥,lipitor,生產批號:75837005)灌胃,假手術組及模型組予以 1ml生理鹽水灌胃 4w。

1.3 行為學檢測方法 灌胃 4w后,采用水迷宮試驗分別檢測 3組大鼠學習和記憶能力。Morris水迷宮包括一個盛水的圓形不銹鋼水池、隱藏在水面下的平臺以及帶有一套圖像自動采集和處理的計算機系統。水池直徑 150cm,池深 60cm。水池按方位平均分為 4個假想的象限。將其中一個象限設置為目標象限(target quadrant),即第 4象限。第四象限中間放置一個大小為 10×10cm2、高 29cm平臺,平臺沒于水面下 1.5cm。水面布滿黑色浮動的樹脂珠以隱蔽平臺。池四周的黃色幕壁上有視覺標志(矩形、三角形、圓形及菱形)等距離分布作為遠端線索,供游泳時的SD大鼠用來定位平臺。在整個實驗期間平臺、水池及周圍環境保持不變。訓練時水溫保持在(25℃±1℃)左右,室內溫度保持在 20℃～25℃。迷宮上方安置帶有顯示系統的攝像機(Cap7130Capture視頻組合),攝像頭對準桶中心,與之相連的計算機系統同步記錄小鼠運動軌跡,采集并分析 Morris水迷宮數據和圖像結果。灌胃 4w后,通過定位航行實驗檢測動物的學習能力,24h后用空間探索實驗檢測動物的記憶能力,每天上午、下午各訓練 1次,每次記錄 120s,連續 5d,計算各組 2次訓練時間的平均值。大鼠在水迷宮中找到平臺的時間越短,游過的距離越短,表明動物學習記憶能力越強。

1.4 標本選擇與保存 行為學檢測后,每組隨機選取 5只大鼠電鏡檢查,剩余的 5只進行 HE染色。大鼠麻醉成功后,以生理鹽水及 4%多聚甲醛快速灌注,在冰臺上,迅速離斷腦組織,按照海馬分區圖譜,取小鼠左側海馬 CA1區(平外側膝狀體水平)1×2×2mm3左右大小海馬(及左額葉組織塊)組織塊 2～3塊,放入 2.5%戊二醛磷酸緩沖液中沖洗后,保存在戊二醛溶液中,HE染色大鼠腦組織放在 4%多聚甲醛中保存備用。

1.5 電鏡標本的體視學分析 采用日立 H-7500透射電子顯微鏡,在 40,000倍數下,選擇神經氈部位,雙盲情況下每組隨機拍照 40張。按 Gundersen法則[5]計數每張相片中 Gray1型突觸的數目;采用德國 Soft Imaging System GmbH圖像分析軟件測量 Gray1型突觸截面積及周長,采用魔棒自動測量突觸小泡的總面積。體視學方法為:δ=4/π×Bx/Ax;Na=Nx/Ar;Vv=Ax/Ar(δ為比表面;Bx為粒子周長;Ax為粒子截面積;π取 3.14;Ar為參照系截面積,Nx為參照系中顆粒截面數目)。

1.6 統計學處理 所有數據采用 SPSS13.0軟件進行分析。計量資料以均數 ±標準差±s)表示,采用單因素方差分析進行比較,兩兩之間比較采用 LSD法。P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Morris水迷宮實驗 治療組與模型組相比較,逃避潛伏期縮短,游泳時間百分比增高,穿過平臺次數增多,表明學習和記憶成績均顯著升高(P＜0.05)。模型組與假手術組相比較,學習和記憶成績均顯著降低(P＜0.05),表明模型建立成功(見表1)。

2.2 大鼠海馬區 HE染色結果 假手術組海馬神經細胞細胞膜及核仁明顯,細胞排列整齊緊密,染色均一(見圖 1A)。模型組海馬神經細胞數量明顯減少,細胞排列稀疏,細胞核深染、固縮,大量膠質細胞增生,細胞退行性變明顯,可見空泡樣改變,組織間水腫較明顯(見圖 1B)。治療組海馬神經細胞排列較模型組整齊,細胞呈圓形或橢圓形,核仁清晰,細胞脫失較少見,反應性膠質細胞減少,水腫較輕(見圖 1C)。

2.3 大鼠海馬區超微結構結果 假手術組大鼠海馬組織神經元雙層核膜結構清晰,核膜平行,細胞質內細胞器結構清楚,未見明顯腫脹及組織空泡樣變性,高爾基體結構清楚,分布規律(圖 2A);模型組大鼠海馬組織中存在較大面積水腫,可見部分空泡樣變性;突觸數量較少,部分突觸中可見水腫,突觸中的突觸小泡數量明顯較少甚至基本消失,突觸間隙不清,突觸后膜厚度薄,突觸界面曲度不大(圖2B);治療組大鼠海馬組織中水腫、空泡樣變性面積較模型組明顯減少,基本消失。突觸結構清楚,形態完整,數量明顯增多,突觸界面較長,曲率較大,突觸間隙較狹,突觸后膜厚度較厚(圖 2C)。

2.3.1 突觸的面數密度 設定 100μm2為參照系截面積。各組突觸的面數密度結果:治療組突觸面數密度較模型組明顯增多,比假手術組明顯減少,各組之間的差異有統計學意義(P＜0.05,見表2)。

2.3.2 截面積和比表面 結果顯示(見表3):模型組中突觸截面積最大,其突觸截面積與治療組比較有統計學意義(P＜0.01)。模型組中突觸比表面最小,其突觸比表面與治療組比較有統計學意義(P＜0.05),假手術組與治療組突觸比表面比較尚不認為有統計學意義。

表 13組大鼠行為學比較結果(±s,n=10)

表 13組大鼠行為學比較結果(±s,n=10)

與模型組相比,*F=4.58、6.24、4.12,P均 ＜0.05

假手術組模型組治療組12.00±1.4142.50±3.5624.13±2.41*46.45±2.2420.26±1.6838.20±1.26*8.60±1.783.42±1.466.60±1.52*

表2 海馬 CA1區突觸面數密度參數定量分析結果±s,n=5)

表2 海馬 CA1區突觸面數密度參數定量分析結果±s,n=5)

與假手術組相比*P＜0.05;與模型組相比 △P＜0.05

假手術組模型組治療組32.86±6.3215.25±4.20△30.51±7.26*

表3 海馬CA1區突觸截面積及比表面定量分析結果±s,n=5)

表3 海馬CA1區突觸截面積及比表面定量分析結果±s,n=5)

與模型組比較*P＜0.05,**P＜0.01

模型組假手術組治療組0.44±0.150.32±0.10**0.31±0.09*0.0078±0.00300.0087±0.0025*0.0083±0.0022△

3 討 論

突觸是神經元之間及神經元與效應器之間相互接觸并實現信息傳遞和功能聯系的部位,突觸的可塑性是學習記憶能力改善的物質基礎,改善海馬突觸可塑性可以增強學習記憶能力。阿托伐他汀是第3代他汀類調脂藥,具有親脂性,可競爭性抑制膽固醇合成酶系中的關鍵酶羥甲基戊二酰輔酶 A(HMGCOA)還原酶,使膽固醇合成受到限制,臨床中主要通過調節血脂,達到預防腦卒中、冠心病、癡呆等的目的。阿托伐他汀可以通過調脂及調脂外作用預防血管性癡呆的發生和發展,已得到大量的大規模臨床研究證實。目前,阿托伐他汀調節血脂防治癡呆的具體機制尚不清楚,大多數研究者認為可能是與穩定血管內皮功能、抗炎、抗血小板聚集、抗氧化等多重作用有關。2008年 Kurinami等[6]運用注射 β淀粉樣肽(Aβ)的小鼠模型評估他汀對于 Aβ介導的認知功能損害的作用,認為他汀類藥物可以減少Aβ的形成,這也可能是其預防癡呆的機制之一。他汀類藥物還可以通過抑制甲羥戊酸合成來減少apoE分泌,降低腦內細胞外 apoE水平,從而阻止老年斑的形成,改善認知功能[7]。Daimon等[8]研究發現,預防性使用普伐他汀 14d,短暫性前腦缺血大鼠海馬區遲發性死亡神經元數量明顯減少,而與血漿中膽固醇水平無明顯相關。

本研究觀察到大鼠的學習和記憶能力有較明顯的提高,這與大多數學者的研究結果一致[1]。研究表明阿托伐他汀治療組血管性癡呆海馬 CA1區Gray1型突觸數量及突觸小泡的含量顯著增加;突觸截面積減小、比表面增大;突觸結構腫脹變性減輕。阿托伐他汀可能增強大鼠的神經元之間或神經元與效應器細胞之間的信息傳遞和功能聯系,促進血管性癡呆大鼠的突觸中神經遞質的產生和儲備,使突觸處于更活化狀態,神經信息傳遞能力增強,從而具有保護突觸結構、減輕突觸變性的作用。

軸突漏(axonal leakage)使軸突中神經遞質等多種成分從軸突漏出,使遠端軸突突觸營養不良和末梢神經遞質減少。本研究發現治療組突觸數量明顯增多、變性減輕、突觸小泡含量增多,分布較均勻,推測阿托伐他汀有改善軸突漏的功能。另外,我們推測其可能的機制主要是:(1)抗炎、抗氧化作用。炎癥反應和氧化應激在血管性癡呆發病機制中的作用越來越受到學者的重視,也被大量的臨床和基礎研究所證實,在使用阿托伐他汀治療后能降低血漿中 MMP-9、CRP等炎癥因子及 8-羥基脫氧鳥苷酸(8-OhdG)、MDA的水平[9]。(2)保護腦血管、增加腦血流量。阿托伐他汀可以穩定血管斑塊、上調擴血管因子的含量和腦源性神經營養因子、增加血管樣結構的形成,特別是促進損傷區邊緣和海馬 CA1區的新生血管發生,這能明顯減輕神經血管功能的損傷,增強受損神經元細胞的存活能力和恢復[10]。本研究發現阿托伐他汀治療組突觸腫脹變性明顯減輕,這可能與抗炎、抗氧化作用及保護腦血管、增加腦血流量有關。

綜上所述,阿托伐他汀可通過多種不同的靶點治療血管性癡呆,其安全、療效較好,具有重要的應用價值。其保護機制可能涉及多途徑、多環節、多靶位的作用,有待深入研究及探討。

圖1 大鼠海馬區 HE染色

圖2 大鼠海馬區電鏡超微結構

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