運(yùn)動神經(jīng)元病患者骨骼肌纖維再生病理研究

趙清石, 江新梅, 鞠 浩, 馬玉剛

運(yùn)動神經(jīng)元病(motor neuron disease,MND)包括肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)、原發(fā)性側(cè)索硬化癥(primary lateral sclerosis,PLS)和脊肌萎縮癥(spinal muscular atrophy,SMA)等,是選擇性的侵犯運(yùn)動系統(tǒng),導(dǎo)致運(yùn)動神經(jīng)元變性,表現(xiàn)為進(jìn)行性肌無力和肌萎縮,目前尚無有效治療方法[1]。有研究發(fā)現(xiàn)炎性肌病及進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良患者骨骼肌內(nèi)存在活躍的肌纖維再生,肌衛(wèi)星細(xì)胞位于肌膜和基底膜之間的單核細(xì)胞,在普通光鏡下觀察,很難與肌膜核區(qū)別開,通過電子顯微鏡可以識別肌衛(wèi)星細(xì)胞,肌衛(wèi)星細(xì)胞在再生過程中起重要作用,其活化、增殖、分化可以修復(fù)受損肌纖維,從而引起再生[2]。但在運(yùn)動神經(jīng)元病中對肌纖維再生的研究甚少,因此促進(jìn)運(yùn)動神經(jīng)元病患者肌纖維再生,及再生肌纖維的增生、肥大可能成為治療該病的一種方法,因此本實(shí)驗重點(diǎn)研究運(yùn)動神經(jīng)元病肌纖維再生特點(diǎn),為治療該病奠定理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集運(yùn)動神經(jīng)元病患者肌活檢骨骼肌標(biāo)本,取少量骨骼肌留做電鏡研究,其中包括肌萎縮側(cè)索硬化癥 4例,脊肌萎縮癥 2例,肌病理象大致正常標(biāo)本 1例作為對照。所有肌病診斷均確立在臨床、輔助檢查、病理診斷基礎(chǔ)之上[3]。所有患者均簽屬手術(shù)同意書。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 Tissue-TEK,3%戊二醛,1%鋨酸,乙醇,Epon 812環(huán)氧樹脂,醋酸雙氧鈾,檸檬酸鉛。鼠抗人神經(jīng)細(xì)胞黏附分子(NCAM)單克隆抗體(1∶50,美國 Santa Cruz Biotechnology公司產(chǎn)品);動物血清(馬血清,中美合資蘭州民生海洋生物有限公司);ABC試劑盒(美國 Vector Laboratories公司產(chǎn)品)等。

1.2.2 儀器 JEM-1200EX型透射電子顯微鏡(日本),尼康光學(xué)顯微鏡(日本),LKB-Ⅲ超薄切片機(jī) (瑞士 )等 。

1.3 方法

1.3.1 組化染色 HE染色。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色分析 冰凍切片丙酮固定(-20℃,10min),4℃ 0.01mol磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer sodium,PBS)(5min,3次);4℃0.3%H2O2/甲醇(30min),PBS(5min,3次 );10%馬血清封閉(30min),1%小牛血清白蛋白/磷酸鹽緩沖液(1%albumin bovine/PBS,BSA)1∶10稀釋抗-NCAM單克隆抗體(Santa Cruz,America),4℃過夜,PBS(5min,3次);1%BSA 1∶200稀釋抗鼠 IgG抗體(CBS,Japan)作為二次抗體,室溫 30min,PBS(5min,3次);ABC(avidin-biotin-peroxidase complex,VECTASTAIN Standard ABC kit)發(fā)色反應(yīng),室溫30min,PBS(5min,3次);0.3%3-3'-二氨基聯(lián)苯胺(3-3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride,DAB/0.05 mol Tris-HCL染色,1%H2O21～1.5ml;室溫 5～10min,PBS終止反應(yīng),流水洗 5min;輕度核染 30～60s,流水洗 10min;依次酒精脫水(75%、85%'95%‘100%),二甲苯透明兩次,加拿大香膠封片。

1.3.3 電子顯微鏡標(biāo)本制作及病理分析 肌肉標(biāo)本切成 1mm3,3%戊二醛中固定,繼之以 1%鋨酸固定,系列丙酮脫水、浸透,Epon812環(huán)氧樹脂包埋,半薄切片定位分析后,制備超薄切片,醋酸鈾-枸櫞酸鉛電子雙染色,JEM-1200EX型透射電子顯微鏡觀察、攝片,進(jìn)行病理分析。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)源性改變患者骨骼肌標(biāo)本組化染色特點(diǎn)和超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

2.1.1 神經(jīng)源性改變 HE染色特點(diǎn) HE染色片中肌萎縮與肥大纖維并存,萎縮肌纖維呈圓型、角型,簇狀分布,其間有相對肥大肌纖維,肌核輕度增加,肌間質(zhì)無異常,可見群萎縮(見圖1)。

2.1.2 抗-NCAM單克隆抗體染色 NCAM作為判斷再生肌纖維的標(biāo)記物,ALS未見肌纖維NCAM染色著色(見圖2);SMA僅見部分小直徑肌纖維 NCAM染色著色(見圖3)。

2.1.3 神經(jīng)源性改變肌肉標(biāo)本的超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 電子顯微鏡下,肌纖維的橫紋保存相對良好,肌原纖維萎縮,可見靜止肌衛(wèi)星細(xì)胞,存在于肌細(xì)胞膜和基底膜之間,胞體成分少,缺乏細(xì)胞器。可見活化的肌衛(wèi)星細(xì)胞,胞體增大,可見肌絲樣結(jié)構(gòu)(見圖4)。可見分裂的肌衛(wèi)星細(xì)胞,胞體增大,染色質(zhì)分為兩部分(見圖5)。

2.2 大致正常骨骼肌標(biāo)本組化和超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)HE染色光鏡下觀察見肌纖維大小基本正常,肌核無增加,肌間質(zhì)正常。電子顯微鏡下觀察見有規(guī)則的橫紋結(jié)構(gòu),未見活化的肌衛(wèi)星細(xì)胞及再生肌纖維。

圖1 HE染色×200

圖2 抗-NCAM染色 ×200

圖3 抗-NCAM染色 ×200

圖4 活化肌衛(wèi)星細(xì)胞 TEM×5000

圖5 分裂中的肌衛(wèi)星細(xì)胞 TEM×8000

3 討 論

骨骼肌纖維再生的過程中,肌衛(wèi)星細(xì)胞活化、增殖和融合起至關(guān)重要的作用[4]。肌衛(wèi)星細(xì)胞在健康人體內(nèi)一般處于休眠狀態(tài),在某些肌病(如進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良和炎性肌病等)狀態(tài)下及某些因素作用下被激活,肌衛(wèi)星細(xì)胞的胞體變大,細(xì)胞器核膜表面的空泡增加,稱為活化的肌衛(wèi)星細(xì)胞,又稱為成肌細(xì)胞。由正常的休眠狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài),經(jīng)分裂、增殖、遷移、融合等過程形成新的肌纖維,在接受神經(jīng)支配、血運(yùn)重建等局部微環(huán)境調(diào)節(jié)下,形成新的再生肌纖維,新形成的肌纖維肥大、增粗,最終形成成熟的肌纖維,去修復(fù)損傷的肌纖維,以補(bǔ)充肌病狀態(tài)造成的肌纖維損失[5]。

衛(wèi)星細(xì)胞的激活不被限制在損傷部位。實(shí)際上,一個肌纖維末端的損傷將要沿著這個肌纖維激活衛(wèi)星細(xì)胞,從而導(dǎo)致衛(wèi)星細(xì)胞增殖和遷移到再生的部位。增殖后,部分肌衛(wèi)星細(xì)胞轉(zhuǎn)為休眠狀態(tài),被儲存于基底膜下,為后來的肌纖維再生所用[6]。肌衛(wèi)星細(xì)胞在發(fā)育過程中的肌肉內(nèi)以及伴有壞死和再生的病理性肌肉內(nèi)(如肌營養(yǎng)不良)數(shù)量明顯增加。是存在于肌細(xì)胞膜和基底膜之間的單核細(xì)胞,普通光鏡下無法將其與肌核分辨開,需要電鏡下觀察[7]。

我們研究的幾例神經(jīng)源性改變的肌病,在電子顯微鏡下均看到有肌衛(wèi)星細(xì)胞的活化、分裂,說明存在肌纖維的再生的早期活動。實(shí)驗觀察到 ALS患者骨骼肌抗-NCAM染色未見到再生肌纖維,而通過電鏡下觀察可見靜止期衛(wèi)星細(xì)胞,包括肌衛(wèi)星細(xì)胞的活化、分裂等,再生處于早期階段,沒有見到融合成較成熟的再生肌纖維,確實(shí)存在吞噬細(xì)胞吞噬肌纖維的過程,但是巨噬細(xì)胞少見,炎性反應(yīng)不活躍,較肌營養(yǎng)不良患者的電鏡下表現(xiàn)相差很多,因此考慮該病再生機(jī)制并非與炎癥介導(dǎo)相關(guān)。實(shí)驗發(fā)現(xiàn) SMA患者骨骼肌在抗-NCAM染色下可見有少量的小徑再生肌纖維,未見發(fā)育成熟的再生肌纖維,臨床上此類患者的肌酸激酶(CK)正常或輕度增高,病理像中可見該病伴有輕微炎性反應(yīng),因此推斷可能該病炎性反應(yīng)參與并介導(dǎo)肌纖維再生,與 ALS再生機(jī)制存在差別,機(jī)體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

有研究表明骨骼肌再生主要取決于 3個方面[8,9]:基底膜的完整;受損肌肉的血供重建;受損肌肉的神經(jīng)支配。此類肌病患者肌纖維神經(jīng)源性改變主要由于失神經(jīng)支配而出現(xiàn)萎縮,因此雖然運(yùn)動神經(jīng)元病患者肌肉內(nèi)存在肌衛(wèi)星細(xì)胞的活化、分裂及早期再生肌纖維,具有再生能力,存在早期再生,但是未見再生肌纖維發(fā)育成熟,不能形成正常肌纖維。因此找到促進(jìn)運(yùn)動神經(jīng)元病患者肌纖維再生、成熟的方法可能是治療該病的另一途徑,有待于進(jìn)一步深入研究。

[1] 馮 凱,許賢豪,孟曉梅等.運(yùn)動神經(jīng)元病的診治進(jìn)展[J].中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志,2006,13(1):57-59.

[2] Tedesco FS,Dellavalle A,Diaz-Manera J,et al.Repairing skeletal muscle:regenerative potential of skeletal muscle stem cells[J].J Clin Invest,2010,120(1):11-19.

[3] 沈定國,吳士文.肌肉疾病[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2007.521-53.

[4] Charlton CA,Mohler WA,Radice GL,et al.Fusion competence of myoblasts rendered genetically null for N-cadherin in culture[J].J Cell Biol,1997,138:331-336.

[5] Karalaki M,Fili S,Philippou A,et al.Muscle regeneration:cellular and molecular events[J].In Vivo,2009,23(5):779-796.

[6] Schultz E,Jaryszak DL,Gibson MC,et al.Absence of exogenoussatellite cell contribution to regeneration of frozen skeletal muscle[J].J Muscle Res Cell Motil,1986,7:361-367.

[7] Ordahl CP,Williams BA,Denetclaw W.Determination and morphogenesis in myogenic progenitor cells:an experimental embryological approach[J].Curr Top Dev Biol,2000,48:319-367.

[8] Abe S,Kasahara N,Amano M,et al.Histological study of masseter muscle in a mouse muscular dystrophy model(mdx mouse)[J].Bull Tokyo Dent Coll,2000,41(3):119-122.

[9] Grefte S,Kuijpers-Jagtman AM,Torensma R,et al.Skeletal muscle development and regeneration[J].Stem Cells Dev,2007,16(5):857-868.