微生物A TP提取方法及其在微波滅菌效果快速評價中的應用研究

葉菁, 王周平, 樂國偉, 施用暉

(江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

微生物A TP提取方法及其在微波滅菌效果快速評價中的應用研究

葉菁, 王周平＊, 樂國偉, 施用暉

(江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

本文對ATP發光技術中微生物ATP提取方法進行了優化研究,通過對不同提取劑提取效率的比較,發現苯扎溴銨提取效果好,并且無需稀釋,能真實體現微生物細胞內的ATP水平。通過對苯扎溴銨提取時間和提取濃度的優化,結果顯示采用體積分數為0.05%苯扎溴銨溶液與菌液混合3～4 min,即可將細胞內的A TP最大限度地釋放出來。將該提取方法與ATP生物發光反應體系偶聯,實現了對微波滅菌效果的快速評價,在短時間內即可得到可靠結果。試驗比較了不同微波功率和微波時間的滅菌效果,實驗結果表明,大腸桿菌ATCC25922在用2450 MHz 650 w微波照射60 s時可被完全殺滅,而金黃色葡萄球菌ATCC25923則需70 s才能被殺滅。當用2450 MHz微波同樣處理60 s時,650 w即可殺滅大腸桿菌ATCC25922,而金黃色葡萄球菌ATCC25923則需700 w才可被完全殺滅。

生物發光;苯扎溴銨;微波滅菌;快速檢測

A TP生物發光技術是一種用于檢測樣品中有無微生物及其數量的方法。這種方法具有簡便、靈敏等特點。ATP生物發光技術的機理是利用蟲熒光素酶催化熒光素、三磷酸腺苷(ATP)、和氧氣反應,將生物能轉化為光能。在熒光素酶催化的發光反應中,ATP在一定濃度范圍內,其濃度與發光強度呈線性關系。由于細菌有細胞膜和細胞壁包裹,必須要將其裂解,才能將細胞內的ATP釋放出來,因此未經處理的細菌是無法檢測其ATP的。目前萃取微生物中ATP的方法很多,主要有:加熱、超聲、酸、有機溶劑等。選擇一種合適的萃取劑和萃取方法,對于測定結果的準確性極其重要。

微波是一種波長為1 mm～1 m(不含1 m)之間的電磁波,其頻率較高,介于300～300 000 MHz。由于其頻率較高,又稱為超高電磁波。消毒與殺菌中常用的是915 MHz與2 450 MHz微波,微波最早用于加熱與干燥,后發現具有殺菌效能。微波基于其熱效應和非熱效應,逐漸用于消毒和滅菌方面[1]。

Webster等國外學者利用生物發光快速、靈敏、重復性好等優點,建立ATP生物發光法快速評定高壓滅菌效果的方法[2],克服了傳統平板培養耗時長,不能立即判定結果的缺點。本文將生物發光技術擴大到快速檢測微波滅菌效果上,分別用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌制備成生物指示劑測試管,進行微波滅菌測試,再用生物發光法測定指示菌短期增菌培養物中ATP的釋放量來判定滅菌效果。結果與傳統平板培養法試驗結果一致。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌菌株ATCC25923,為本實驗室保存。將受試菌用營養肉湯培養至OD600為0.3～0.4,4℃保存備用。

重組蟲熒光素,重組蟲熒光素酶均為Promega公司產品。ATP標準品購于Amresco。苯扎溴銨(新潔爾滅)購于上海運佳黃浦制藥有限公司,三氯乙酸(以下簡稱TCA)購于國藥集團化學試劑有限公司。緩沖體系采用Tris-HCl(p H=7.4)。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器

電子天平(METTL ER TOL EPQ AB204-N); PH計(METTLER TOLEPQ);不銹鋼自動手提式壓力蒸汽滅菌鍋:上海申安醫療器械廠產品;隔水式恒溫培養箱:寧波機電工業研究設計院;標準型凈化工作臺:蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;迴轉式恒溫調速搖瓶柜:上海新蕊自動化設備有限公司;電腦型變頻微波爐:松下;MPI-B型多參數化學發光分析測試系統:西安瑞邁分析儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 提取劑及提取方法的選擇

1)微生物ATP提取方法的選擇

(1)TCA法:將0.5 mL菌液與等體積預冷的0.03 g/mL的TCA混合,振搖3 min后加入20倍體積的緩沖液加以稀釋,以終止其反應。

(2)氯仿提取法:按參照文獻[3]對樣品進行提取。

(3)苯扎溴銨提取法:取100μL 5×10-4g/mL的苯扎溴銨溶液與等體積的菌液混合3 min。(為了使結果有可比性,將用氯仿和苯扎溴銨提取得到的ATP同樣稀釋20倍)。

取100μL上述提取劑與菌液的混合液,加入到400μl酶反應液(1×10-6mol/L蟲熒光素酶,5× 10-6mol/L熒光素,25 mmol/L tris-HCl緩沖液,1 mmol/L Mg2+)中,立即放入MPI-B型多參數化學發光分析測試系統中測定BL發光值。

2)提取劑濃度的優化 配制不同濃度的苯扎溴銨溶液(5×10-5、1×10-4、5×10-4、1×10-3、2× 10-3、4×10-3g/mL),取100μL提取劑與等體積的受試菌液混合3min后,以同樣的方法測定BL發光值。

3)提取時間的選擇

取100μL 5×10-4g/mL的苯扎溴銨溶液,與等體積的受試菌液混合不同的時間(1、2、3、4、5min)后,用同樣的方法測定BL發光值。

1.3.2 微波滅菌測試

1)滅菌時間對滅菌效果的影響

用2 450 MHz650W微波對受試菌液進行不同時間的照射(40、50、60、70、80、90、100、110 s),處理后的菌液在無菌條件下分為3組:第一組制成純細胞懸液(4℃存放)作本底測定用;第二組菌液接種到平板上37℃培養24 h作為對照;剩余菌液進行搖床培養7h后以同樣的方法制成純細胞懸液進行生物發光檢測。

2)滅菌功率對滅菌效果的影響

固定滅菌時間為60s,用2 450 MHz微波變換不同功率(1 000、820、700、650、500 w)處理菌液,處理后的菌液以同樣的方法制成純細胞懸液以及進行平板培養。

1.3.3 生物發光測定 由于熒光素酶對反應體系條件要求嚴格,作者做了一些前期工作,對熒光素酶的最適反應體系進行了研究,包括緩沖液的種類、離子強度、p H、金屬離子的種類以及濃度,最適的反應溫度等。由于熒光素、熒光素酶價格昂貴,為節約成本,故對兩者的最低反應濃度也做了摸索,在試驗中所用的酶反應體系為25 mmol/L tris-HCl作為緩沖體系,p H 7.4,Mg2+濃度為1 mmol/ L,蟲熒光素酶濃度為1×10-4mol/L,蟲熒光素濃度為5×10-4mol/L,最適反應溫度為25℃。

取100μL0.05%的苯扎溴銨溶液與等體積的菌液混合3～4 min(大腸桿菌菌液混合3min,金黃色葡萄球菌混合4 min)后,取100μL上述混合液置于石英發光小管中,加入400μL酶反應液在MPI-B型多參數化學發光分析測試系統中測定BL發光值。

2 結果與討論

2.1 提取劑及提取方法的選擇

目前常用的提取細菌中ATP的方法主要是加熱、加熱超聲、酸、有機溶劑等。有文獻[4]報道超聲加熱提取ATP的效果最佳,加熱次之,它們對于ATP分析的抑制較小,萃取率高,但需要附加設備,操作繁瑣,難于推廣。超聲方法的淬取效果尚可,但不能使apyrase變性,故會水解微生物A TP,從而使檢測得到細菌ATP水平較實際水平大為降低。國外文獻[5-8]報道采用陽離子表面活性劑,特別是季胺鹽類陽離子表面活性劑如苯扎氯銨(BAC),苯扎溴銨(BAB)作為細菌細胞ATP提取劑的主要成分,并且證明在提取ATP效果上上述兩種消毒劑與常用的TCA法同樣有效,并且無需稀釋,因此這種提取方法最能真實反應細胞中的ATP水平,測定結果更為準確。

本文對TCA提取法、苯扎溴銨提取法以及常用的氯仿提取法提取細菌ATP的效果進行了比較,結果如圖1。

圖1 不同提取方法提取細菌ATP的效果Fig.1 ATP extracted effects with different extraction methods

試驗結果表明氯仿的淬取效率最低,可能是由于氯仿無法使apyrase變性而水解細菌ATP,使檢測到的ATP水平較實際值低。TCA提取法與苯扎溴銨提取法效果相近,但是由于TCA對熒光素酶體系有很強的抑制作用,故需要大量稀釋才可檢測發光值,無法真實反應細胞的ATP水平,故本試驗采用苯扎溴銨作為細菌ATP的提取劑。

提取劑的濃度除了對發光反應的穩定性有影響外,還對細菌ATP的提取效果有很大的影響,圖2表明BAB提取兩種細菌細胞內ATP的適宜濃度范圍,其中兩種細菌的OD600值分別為:大腸桿菌0.421,金黃色葡萄球菌0.386。

圖2 BAB濃度對提取兩種細菌ATP效果的影響Fig.2 Effect of BAB concentration on the ATP extraction from two kind of bacteria

實驗結果表明,BAB提取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細胞內ATP的最適濃度均為5×10-4g/ mL,故在后續實驗中,采用5×10-4g/mL苯扎溴銨溶液作為ATP提取劑。

BAB需要一定的時間才能達到殺菌的目的,其與細菌混合的時間和提取細菌內ATP的效率有關,同時與被提取的細胞內ATP的降解過程也有關系,因此,每次生物發光反應中加入ATP提取劑與加入蟲螢光素一螢光素酶之間的時間間隔必須保持一致,否則將影響實驗結果的重復性。5× 10-4g/mL BAB與細菌的作用時間對生物發光反應強度的影響見圖3,其中兩種細菌的OD600值分別為:大腸桿菌0.443,金黃色葡萄球菌0.408。

圖3 BAB作用時間對提取細菌ATP的影響Fig.3 Effect of BABtreatment time on the ATP extraction from bacteria

試驗結果表明,對不同種類的細菌提取ATP,所需的最適時間不同,對于大腸桿菌,提取時間為3min,而提取金黃色葡萄球菌A TP的最適時間為4min。

2.2 微波滅菌測試

根據Webester等報道,細菌經滅菌處理后,如滅菌不徹底(只要達到100 cfu/L活菌存在),殘余活菌在適宜的條件下,經過遲緩期后進入對數生長期,釋放ATP的細菌數將以幾何級數增大。因此,孵育5h即可觀察到生物發光值的大幅度提高。但作者通過試驗發現,孵育5 h并不能觀察到A TP的明顯增加,故延長孵育時間至7 h。

2.2.1 滅菌時間對滅菌效果的影響

2 450 MHz,650 w的微波處理兩種供試菌株時(結果如圖4,圖5),不耐熱的大腸桿菌在60 s時已全部被殺滅;而金黃色葡萄球菌在70 s之后才完全被殺滅。實驗結果表明,用微波滅菌的效率高,操作簡便。并且隨滅菌時間的延長,細菌的死亡率明顯增加,在較短的時間內即能完全殺滅細菌。以24h平板培養試驗作為對照,結果一致。

圖4 微波效果評價(大腸桿菌)Fig.4 Evaluation on the effect of microw ave sterilization(E.coli)

圖5 微波效果評價(金黃色葡萄球菌)Fig.5 Evaluation on the effect of microw ave sterilization(S.aureus)

圖6 微波滅菌效果評價(大腸桿菌)Fig.6 Evaluation on the effect of microw ave sterilization(E.coli)

圖7 微波滅菌效果評價(金黃色葡萄球菌)Fig.7 Evaluation on the effect of microw ave sterilization(S.aureus)

2.2.2 滅菌功率對滅菌效果的影響 固定殺菌時間為60s,用2 450 MHz不同功率(1 000、820、700、650、500 W)的微波照射菌液(結果如圖6,圖7),在500 W的微波功率下處理60 s,大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均未完全殺滅,當用650 W功率微波照射60 s,大腸桿菌完全被殺滅,而金黃色葡萄球菌在用700 W功率微波照射同樣的時間后完全被殺滅,殺菌效果明顯,并且所需時間短。對照平板培養試驗,結果一致。在微生物細胞A TP生物發光法快速檢測中,微生物細胞中的A TP從胞內釋放出來是關鍵的第一步,因此選擇一種合適的提取劑和提取方法是至關重要的。常用的提取方法有超聲,加熱,氯仿,TCA法等,由于前兩種操作繁瑣,需附加設備,因此難于廣泛應用,而氯仿法提取效率低,無法真實反應細胞內的A TP水平。TCA法雖然提取效果較好,但其對發光反應體系中熒光素酶活性抑制較大,測定時必須進行大量稀釋,這就必然降低檢測靈敏度。在國外已漸漸開始使用季胺陽離子表面活性劑作為ATP提取劑,既保持了較高的提取效率,又克服了TCA需大量稀釋的缺點,但這一方法在國內未見報道。本試驗對苯扎溴銨作為ATP提取劑的提取條件進行了優化,并將其成功應用到生物發光技術中,用以評價微波滅菌效果。

3 結語

微波滅菌以其快速,簡便的優點已廣泛用于食品、中藥、醫療器械等物品的滅菌,在滅菌效果的質量檢測方法中,最可靠的就是生物指示劑法,通常被作為滅菌效果的最終鑒別,用以評價滅菌設備、滅菌工藝、滅菌效果的。而傳統的平板培養法雖然結果可靠,但是需要的時間長(超過24 h),不能立即判斷結果,對于立即使用的物品作為滅菌效果的評價缺乏實際意義。本實驗建立s用生物發光法評價微波滅菌效果的方法,通過測定滅菌后孵育7 h后ATP的釋放量是否增加來判定滅菌效果。此方法結果可靠,又可在短時間內獲得正確的結論,使生物指示劑法在評價滅菌效果的質量監測上更具實際意義。

[1]胡新宇,寧正祥.食品滅菌新技術[J].中國食品工業,2000,7(12),40-42.

HU Xin-yu,NING Zheng-xiang.New technology in food sterilization[J].China Food Industry,2000,7(12):40-42

[2]Webster J J,Bronstin I,Edwards B,et al.Biolumin[J].Chemilumin,1988,2(2):120-125.

[3]RSiragusa G,Dorsa W J,Cutter C N.Biolumin[J].Chemilumin,1996,11(6):297-301.

[4]舒柏華,趙志耀,徐順清,等.利用生物發光技術快速檢測微生物的方法學研究[J].發光學報,1999,20(1),230-231.

SHU Bai-hua,ZHAO Zhi-yao,XU Shun-qing,et al.Study on the rapid bioluminescence assay method for the detection of bacteria[J].Chinese Journal of Luminescence,1999,20(1),230-231.(in Chinese)

[5]Kenichi Noda,Tadahiro Matsuno,Hiroya Fujii,et al.single bacterial cell detection using a mutant lucferase[J].Biotechnol.Letters,2007,30:1051-1054.

[6]AAnsehn S,Lundin A,Nilsson L,et al.Proceedings of international symposium on analytical applications of bioluminescence and chemiluminescence[C].Westlake Village:CA:State Printing&Publishing,1979,438-445.

[7]Siro M,Romar H,Lovgren T.Continuous flow method for extraction and bioluminescence assay of ATP in baker’s yeast [J].Applied Microbiology and Biotechnology.1982,15:258-264.

[8]Kolehmainen S E,Tarkkanen V.Selective determination of nucleotides in viable somatic and microbial cells:US,4,303, 752,[P].1981-05-13.

[9]凌云,趙渝,徐亞同,等.發光細菌法在食品安全性檢測中的應用[J].食品與生物技術學報,2005,24(6),106-109.

LING Yun,ZHAO Yu,Xu Ya-tong,et al.Application of photobacteria in food safety inspection[J].Journal of Food Science and Biotechnology,2005,24(6),106-109.(in Chinese)REN Hai-lin,Study on preparation of quaternary alkaloid cationic tapioca starch[J].Journal of QiQiH ar University,2007, 23(3):10-12.(in Chinese)

(責任編輯:楊萌)

[3]劉華,劉溫霞,劉謙.陽離子淀粉的制備以及在造紙工業中的應用[J].造紙化學品與應用,2007,(2):32-34.

LIU Hua,LIU Wen-xia,LIU Qian.The preparation and application in the paper-making industry of cationic starch[J]. Hunan PaperMaking,Paper Science&Technology,2007,(2):32-34.(in Chinese)

[4]許開紹,羅軍,黃崇杏.AKD專用高分子乳化劑的研制[J].紙科學與技術,2002,21(5):26-29.

XU Kai-shao,LUO Jun,HUANG Chong-xing.The preparation of polymeric emulsifier of AKD emulsion[J].Paper Science&Technology,2002,21(5):26-29.(in Chinese)

[5]沈一丁,李勇進.高取代度陽離子淀粉的制備與應用[J].造紙化學品,2002,(3):9-12.

SHEN Yi-ding,LI Yong-jin.Preparation of the highly substituted cationic starch and its application as the dry strengtherring agent for papermaking[J].Paper Chemicals,2002,(3):9-12.(in Chinese)

[6]陳啟杰,陳夫山,王高升.半干法制備高取代度陽離子淀粉[J].造紙化學品,2004,16(1):24-27.

CHEN Qi-jie,CHEN Fu-shan,WANG Gao-sheng.Preparation of cationic starch with high substituted degree using halfdry process[J].Paper Chemicals,2004,16(1):24-27.(in Chinese)

[7]張曉宇,童群義.半干法制備低取代度陽離子淀粉研究[J].食品與生物技術學報,2005,24(5):94-97.

ZHANG Xiao-yu,TONG Qun-yi.Preparations of cationic starch with low degree of substitution using the semi-dry process[J].Journal of Food Science and Biotechnology,2005,24(5):94-97.(in Chinese)

[8]Hassler,Thord G.Paper size and paper sizing process[P].WO 97/35068,1997-09-25

[9]GB1l543-89.表面活性劑乳液的特性測試及其乳化能力的評定方法[S].北京:中國標準出版社,1989.

(責任編輯:朱明)

Optimization and application of ATP Bioluminescence System in the Rapid Evaluation of Microwave Sterilization

YE Jing, WANG Zhou-ping＊, L E Guo-wei, SHI Yong-hui
(School of Food Science and Engineering,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

In this manuscript,the extraction method of microorganism ATP used in bioluminescence techniques were studied.According to compare the extract results of different extractants,it was found that that benzalkonium bromide(BAB)is the best extractant to extract all of ATP microorganism cells.The extraction conditions including the extractant concentration and the extaction time were determined and listed as follows:0.05%BAB mixing with bacteria cells for 3-4 min.The finding was applied to rapidly evaluate the effect of microwave sterilization coupling with bioluminescent technology and the reliable results can be obtained within a short time.According to the sterilization effect of different microwave power and sterilization time,we found that E.Coli ATCC25922 can be completely exterminated irrediated by 2 450 MHz 650 w microwave for 60 s but 70 s for Staphylococcus aureus A TCC25923.When treated with 2450 MHz microwave all for 60 s,the power for compelte extermination of E.Coli ATCC25922 is 650w but 700 s for Staphylococcus aureus ATC25923.

bioluminescence,benzalkonium bromide(BAB),microwave sterilization,rapid detection

TL 271.5

:A

1673-1689(2010)02-0172-05

2009-04-16

國家863計劃項目(2008AA10Z419),國家自然科學基金項目(20805019),江南大學科學基金項目。

＊通信作者:王周平(1974-),男,陜西鳳翔人,理學博士,教授,博士生導師,主要從事食品營養與安全分析研究。Email:wangzp@jiangnan.edu.cn