通過母血中胎兒表觀遺傳學(xué)標(biāo)記物預(yù)測子癇前期的探討

劉潤花，王 健，武永明，郭俊成，穆雅琴，趙富璽*

(1.山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山西大同 037009；2.山西大同大學(xué)免疫研究所，山西大同 037009）

通過母血中胎兒表觀遺傳學(xué)標(biāo)記物預(yù)測子癇前期的探討

劉潤花1，王 健2，武永明1，郭俊成2，穆雅琴2，趙富璽2*

(1.山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山西大同 037009；2.山西大同大學(xué)免疫研究所，山西大同 037009）

目的通過實時熒光定量PCR法測定孕婦血漿中胎兒表觀遺傳學(xué)標(biāo)記物非甲基化絲氨酸蛋白酶抑制劑B5(un-methylated serpin peptidase inhibitor，clade B，member 5，U-maspin)基因的含量，初步探討母血漿中U-maspin基因的定量能否預(yù)測子癇的發(fā)生.方法隨機(jī)選擇子癇前期孕婦40例為實驗組，其中輕度和重度患者各20例，以健康同期妊娠婦女20例為對照組.提取血漿游離DNA，用甲基化特異性PCR(MSP)方法檢測各組血漿標(biāo)本中U-maspin基因的含量.結(jié)果子癇前期組孕婦血漿中U-maspin的水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)，輕、重度子癇前期患者平均濃度有差異，分別為1 402.05 copies/mL及2 189.60 copies/mL(P＜0.05).結(jié)論U-maspin基因作為孕婦血漿中游離的胎兒特異性表觀遺傳學(xué)標(biāo)記物，可以預(yù)測子癇的發(fā)生.

孕婦血漿 非甲基化maspin 熒光定量PCR 產(chǎn)前診斷 子癇前期

子癇前期是妊娠期特有疾病，是孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒發(fā)病及死亡的主要原因之一.以往的研究通過檢測Y染色體特異性序列和父源性的基因多態(tài)性位點，證明了游離胎兒DNA在子癇前期孕婦血漿中異常增加，這種變化與病情的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[1].但是，這種方法受到了胎兒性別和基因多態(tài)性的局限.目前，有研究者應(yīng)用表觀遺傳學(xué)方法，利用母親和胎兒DNA甲基化的差異性，在孕婦體內(nèi)檢測到了一種特異的表觀遺傳標(biāo)志物U-maspin[2]，突破了在母血中檢測游離胎兒DNA的局限性.本研究將表觀遺傳學(xué)方法用于測定子癇前期孕婦血漿中游離胎兒DNA的含量變化，為非創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷提供新的思路.

1 資料與方法

1.1 對象

選擇2008年7月-2009年5月在山西大同第一、三、五人民醫(yī)院就診、定期產(chǎn)前檢查妊娠26～41周的孕婦60例，其中子癇前期患者40例又區(qū)分出輕度、重度各20例為實驗組，年齡27～40歲，平均孕周32±3.6周，健康晚期妊娠婦女20例為對照組，年齡26～39歲，平均孕周32±2.5周，兩組孕婦年齡、孕周比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05).分別簽署知情同意書.

1.2 方法

1.2.1 樣本的制備

抽取孕婦外周血4mL置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，2 000 r/min離心10min，吸取上清置于滅菌的EP管中，13 000 r/min離心5 min，吸取上層血漿，分裝于1.8mL的凍存管中，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.2.2 血漿中游離DNA的提取

取待檢血漿1.2mL，應(yīng)用QIAamp Blood Kit(Qiagen，德國)，根據(jù)其操作手冊提取DNA，最后每份DNA標(biāo)本用50μLBuffer AE洗脫，-20℃冰箱保存.

1.2.3 引物、探針的設(shè)計與合成

U-maspin引物為 F：5’-TTTTATTTT ATT GAATATTTTATTTT TTGGTTTCGT-3’，R：5’-AAAAAAAACTATAAATTACATACATA CATACAAACATGCA-3’，探針：5’-FAM-TGGGTTGAGAGGATTGT-MGB-3’，由上海生工生物工程公司合成.

1.2.4 甲基化特異性 PCR (methylation-specific PCR，MSP)

用Chemicon公司CpGenomeTM DNA Modification Kit進(jìn)行DNA亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，均按說明書操作.采用FTC-2000實時熒光定量PCR儀(Funglyn Biotech公司，加拿大)，擴(kuò)增U-maspin基因.反應(yīng)體系：取模板DNA 20μL，Premix Ex TaqTM 25 μL(TaKaRa提供)，10μM引物各1.5μL，10μM TaqMan探針1μL，加雙蒸水至總體積50μL.反應(yīng)條件：95℃，3 min；40個循環(huán) (94℃20 s，60℃20 s，72℃30 s)；每個循環(huán)結(jié)束時PCR儀自動檢測一次熒光值.利用已知濃度含目的基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(上海生工提供)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.為了實驗的準(zhǔn)確性，減少污染，在實時定量PCR擴(kuò)增系統(tǒng)中同時做陰性對照及空白(三蒸水)對照.記錄U-maspin的CT值(每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的熒光閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到其靶定量值.采用如下的方程進(jìn)行計算：C＝Q×VDNA/ VPCR×Vext，C＝血漿中目的基因的靶濃度(copies/ml)，Q＝PCR檢測到的靶定量值 (copies)；VDNA＝提取后得到的DNA模板總量；VPCR＝進(jìn)行PCR的血漿模板量；Vext＝提取出的血漿總量.

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，三組樣本均服從正態(tài)分布 (P＞0.05)，所有計量資料值以 χ±s表示，經(jīng)方差齊性分析(P＜0.05)，多樣本間均數(shù)比較采用 K ruskal-Wallis檢驗，采用Bonferroni法進(jìn)行樣本間的多重比較.P＝0.05為檢驗標(biāo)準(zhǔn).

2 結(jié)果

2.1 各組中U-maspin基因的檢出率

60例孕婦血漿中均檢測到了U-maspin基因，檢出率為100%，如圖1.

圖1 U-maspin基因的擴(kuò)增曲線

2.2 孕婦血漿中U-maspin基因的定量分析

三組孕婦血漿中U-maspin基因含量比較，差異存在顯著性 (P＜0.01，表1、圖2).子癇前期組血漿中U-maspin基因濃度明顯高于正常晚期妊娠組(P＜0.01).重度子癇前期患者血漿中該基因含量的平均水平是輕度子癇前期患者的1.56倍，見表1.

表1 三組孕婦血漿中U-maspin基因的濃度

圖2 三組孕婦血漿中U-maspin基因濃度的比較

3 討論

3.1 孕婦血漿中的游離胎兒DNA

傳統(tǒng)的獲取胎兒遺傳信息進(jìn)行產(chǎn)前診斷的方法如羊膜腔穿刺術(shù)、絨毛膜取樣、臍帶取血等均具有創(chuàng)傷性，有的甚至造成孕婦的感染、流產(chǎn).1997年，Lo等發(fā)現(xiàn)在孕婦的外周血中存在著游離胎兒DNA，這為非侵入性產(chǎn)前診斷提供了新的途徑.測定母血中游離胎兒DNA對診斷、治療、預(yù)測這些疾病預(yù)后有重要意義：①檢測母血中胎兒Y染色體序列以診斷X連鎖顯性或隱性疾病[3];②通過相對染色體劑量的方法產(chǎn)前診斷21三體綜合征[4];③通過父源突變體預(yù)測遺傳病[5];④應(yīng)用血清中游離DNA檢測胎兒RhD基因型，準(zhǔn)確率高達(dá)100%[6];⑤在早產(chǎn)[7]、子癇前期[8]孕婦血清中游離胎兒DNA的含量異常高于正常孕婦血清中的含量，且臨床癥狀越重升高越明顯.然而，由于孕婦外周血中游離胎兒DNA只占母血總游離DNA的3%-6%[9]，有效地提取胎兒DNA尤為重要.本實驗通過兩步離心法提取血漿，確保血細(xì)胞完全清除.使用QIAamp Blood Mini Kit提取DNA，通過加大血漿的投入總量來增加微量目的基因的濃度;為了防止蛋白、鹽分等污染，用試劑盒中的bufferAW1、bufferAW2反復(fù)洗脫;為保證最終模板DNA的濃度，將洗脫后的TE液再次入柱離心;用熒光定量PCR檢測對母體血漿中U-maspin基因絕對定量，Lo[9]等證實這種檢測技術(shù)靈敏到足以檢測出一個拷貝的基因量，準(zhǔn)確率幾乎達(dá)到100%.

3.2 表觀遺傳學(xué)方法在非創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

目前，大量的應(yīng)用研究都是通過Y染色體特異的序列SRY、DYS14[3]提取孕婦外周血中胎兒DNA，然而這些序列的診斷僅適用于50%的懷男性胎兒的孕婦.后有大量的研究集中在短串聯(lián)重復(fù)序列(STRs)[10]和單核苷酸多態(tài)性(SNPs)上，但明顯增加了實驗的復(fù)雜性，也不利于臨床應(yīng)用.關(guān)于孕婦外周血中胎兒mRNA的研究還尚不成熟.應(yīng)用表觀遺傳學(xué)DNA甲基化技術(shù)，從母親和胎兒DNA甲基化的差異性上突破母血中檢測胎兒DNA技術(shù)的局限性，取得了新進(jìn)展.Chim等[2]研究證實，maspin基因在胎盤細(xì)胞中處于非甲基化狀態(tài)，而在母血細(xì)胞中處于高甲基化狀態(tài)，非甲基化的maspin序列中存在胎兒SNP基因型，可以作為不受胎兒性別和遺傳多態(tài)性影響的通用標(biāo)記物.這就提供了一種將母體循環(huán)游離胎兒DNA檢測用于臨床的工具，代表著非創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷從過去的研究向前邁進(jìn)了一大步.本實驗表明在60例孕婦中均檢測到了U-maspin基因，檢出率為100%.

3.3 孕婦血漿中胎兒游離DNA定量在子癇前期預(yù)測中的意義

妊娠期高血壓疾病在妊娠中發(fā)生率大約為5%～10%[11]，嚴(yán)重影響母嬰健康，目前其確切病因未明，因此，提高該病的預(yù)防與預(yù)測就顯得格外重要.目前較普遍的預(yù)測方法如平均動脈壓、翻身試驗、血液流變學(xué)試驗、尿鈣排泄量測定等以及某些生化學(xué)方法的預(yù)測雖有著一定的提示作用，但均非胎兒所特有的標(biāo)志物.近年來，大量的研究[12]證明了由于子癇前期孕婦胎盤及其血管內(nèi)皮的損害，使血漿中存在大量的游離DNA，其中胎源性DNA量明顯高于正常妊娠組.本研究檢測了子癇前期孕婦血漿中U-maspin基因的含量，平均濃度為1 795.83 copies/mL.與相同孕周的正常孕婦相比，胎兒DNA上升了4.06倍.表明孕婦外周血中U-maspin基因濃度的異常變化是預(yù)測子癇前期的一個重要指標(biāo).本實驗進(jìn)一步分析了輕、重度子癇前期中U-maspin基因含量的差異，證實了這種游離胎兒標(biāo)記物與子癇前期的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，可以提示子癇前期-子癇的發(fā)生及預(yù)后.

本研究證實了孕婦血漿中U-maspin基因可以作為一種非性別和基因多態(tài)性依賴的胎兒特異性標(biāo)記物應(yīng)用于子癇前期的產(chǎn)前診斷中.尚需進(jìn)一步大樣本的前瞻性研究，并可望能在子癇前期臨床癥狀發(fā)生前即可檢測到胎兒DNA的異常升高.

[1]Tjoa M L，Cindrova D T，Spasic B O，et al.Trophoblastic Oxidative Stress and the release of Cell-Free Feto-Placental DNA[J].Am JPathol，2006，169：400-404.

[2]Chim SSC，Tong Y K，Chiu RW K，et al.Detection of the placental epigenetic signature of themaspin gene inmaternal plasma [J].Proc Natl Acad Sci，2005，102：14753-14758.

[3]Picchiassi E，Coata G，F(xiàn)anetti A，et a1.The best approach for early prediction of fetal gender by using free fetal DNA from maternal plasma[J].Prenat Diagn，2008，28：525-530.

[4]Lo Y M D，Lun FM F，Chan K C A，et al.Digital PCR for themolecular detection of fetal chromosomal aneuploidy[J].Proc Natl Acad Sci，2007，104：13116-13121.

[5]Aragones A B，Tiebas M JT，Merlo JG，et al.Prenatal diagnosis of Huntington disease in maternal plasma：direct and indirect study[J].Eur JNeurol，2008，15：1338-1344.

[6]Geifman-Holzman O，Grotegut C A，Gaughan JP.Diagnostic accuracy of noninvasive fetal Rh genotyping from maternal blood--a meta-analysis[J].Am JObstetGynecol，2006，195：1163-1173.

[7]Farina A，LeShane E S，Romero R，et al.High levels of fetal cell-free DNA in maternal serum：A risk factor for spontaneous preterm delivery[J].Am JObstetGynecol，2005，193：421-425.

[8]Hahn S，Huppertz B，Holzgreve W.Fetal cells and cell free fetal nucleic acids in maternal blood：new tools to study abnormal placentation[J].Placenta，2005，26：515-526.

[9]Lo Y M D，Tein M S，Lau TK，etal.Quantitative analysis of fetal DNA inmaternal plasma and serum：implications for noninvasive prenatal diagnosis[J].Am JHum Genet，1998，62：768-775.

[10]Vodicka R，Vrtel R，Dusek L，et al.Refined fluorescent STR quantification of cell-free fetal DNA during pregnancy in physiological and Down syndrome fetuses[J].Prenat Diagn，2008，28：425-433.

[11]Caroline FW，Hilary B.The use of cell-free fetal nucleic acids in maternal blood for non-invasive prenatal diagnosis[J].Hum Reprod Update，2009，15：139-151.

[12]Sekizawa A，F(xiàn)arina A，Sugito Y，et a1.Proteinuria and hypertension are independent factors affecting fetal DNA values：A retrospective analysis of affected and unaffected patients[J].Clin Chem，2004，50：221-224.

The Approach of the Quantitative Analysis of Fetal Epigenetic Signature in M aternal Plasma in Pre-eclam psia

LIU Run-hua1，WANG Jian2，WU Yong-ming1，GUO Jun-cheng2，MU Ya-qin2，ZHAO Fu-xi2
(1.Medical School of ShanxiDatong University,Datong Shanxi,037009；2.Research Institute of Immunology，Shanxi Datong University，Datong Shanxi，037009)

Objective Apply Fluorescence quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR)to quantify un-methylated serpin peptidase inhibitor，clade B(un-methylated maspin)gene in maternal plasma，and to study if it can be used to predict eclampsia.Methods Forty pre-eclamptic pregnantwomen includingmild pre-eclampsia(20 cases)and severe pre-eclampsia(20 cases)were selected as study guoup，twenty gestational age-matched normal pregnancieswere selected as control group.Free DNA of plasma sampleswas extracted，Themethylation-specific PCR (MSP)method was used to detect the expression of U-maspin gene.Results The level of fetal DNA in preeclampsia was higher than thatof controls(P＜0.05).Therewas significant difference betweenmild and severe pre-eclampsia subjects，Themean concentrationswere 1 402.05 copies/mL and 2189.60copies/mL(P＜0.05)respectively.Conclusion U-maspin genemay be considered as a epigenetic marker to detect the fetal DNA in maternal plasma，and itmaybe helpful to predicteclampsia.

maternal plasma；un-methylated maspin；fluorescence quantitative PCR；prenatal diagnosis；pre-eclampsia

R714

A

〔編輯 楊德兵〕

1674-0874(2010)02-0044-04

2009-09-15

國家人口計生委資助項目[2005]11號C1-41；山西省科技廳攻關(guān)項目[NO.20080311072]

劉潤花(1957-)，女，山西朔州人，實驗師,研究方向:遺傳與免疫學(xué).*趙富璽,教授,碩士生導(dǎo)師,通信作者.