微小亞歷山大藻對黑鯛仔魚的抗氧化酶和ATPase的脅迫影響

蔣玫，黃世林，倫鳳霞，夏培艷

(1. 中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 200090；2. 國家海洋局第二海洋研究所，浙江 杭州 310012；3. 上海市水文總站 上海 20023；4. 上海海洋大學，上海 200336)

微小亞歷山大藻對黑鯛仔魚的抗氧化酶和ATPase的脅迫影響

蔣玫1，黃世林2，倫鳳霞3，夏培艷4

(1. 中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 200090；2. 國家海洋局第二海洋研究所，浙江 杭州 310012；3. 上海市水文總站 上海 20023；4. 上海海洋大學，上海 200336)

研究了暴露于微小亞歷山大藻藻液中的黑鯛仔魚其超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、過氧化物酶(CAT)和Na+-K+-ATPase酶活性在4 d時間內的變化，結果表明，微小亞歷山大藻藻液對仔魚的GSH-PX和CAT活性誘導作用明顯，尤其對處于染毒時間2 d內，這種作用較強，但隨著實驗時間的延長又表現出抑制作用。微小亞歷山大藻藻液對SOD也有強烈的誘導作用，這種作用可持續3 d，但隨后則表現為抑制作用。仔魚的3種酶活性與染毒的藻液均符合較明顯的劑量－效應關系，即實驗藻液濃度越大，對酶活性的抑制率越低，對生物毒性越大。但藻液對于Na+-K+-ATPase酶卻表現出強烈的抑制作用，顯示出濃度－效應關系。其與上述3種酶的活力變化可以一起作為水體中藻液污染的生物指示器。

微小亞歷山大藻，仔魚，抗氧化酶，ATPase

藻毒素不僅能直接導致漁業生物的大量死亡[1],甚至還可通過影響魚類的幼體或生活史的其它階段改變海洋營養結構[2]。微小亞歷山大藻能產生一種稱為麻痹性貝毒 (PSP) 的藻毒素。大量的研究表明，藻毒素具有極高的細胞選擇性，在生物機體內所引發的許多細胞學變化，主要緣于生物體酶系統的破壞，從而引發一系列的中毒特征。例如低細胞密度藻對菲律賓蛤仔、翡翠貽貝的鰓組織的Na+-K+-ATPase酶活性的有激活作用，而高密度藻則能抑制蛋白磷酸酶的活性，導致蛋白質磷酸化和去磷酸化調節失衡，最終對生物的多種生理功能造成影響[3]。此外，麻痹性毒素還能通過賴膽酸轉運系統進入細胞，引起乳酸脫氫酶 (LDH) 釋放率和細胞內活性氧基 (ROS) 的升高，產生脂質過氧化引起的氧化損傷的毒性現象，使得水生生物的肝臟表現出充血紅腫和血斑的中毒癥狀[4]。

不少學者認為，魚類對外源物的生物轉化中，可生成危害性大的活性氧中間代謝物，并產生大量的活性氧自由基，這些活性氧會對機體造成氧化脅迫, 引起酶失活[5,6]。GSH-PX是魚體內廣泛存在的一種重要的催化過氧化物分解的酶類。SOD、CAT則是魚類體內參與免疫防御的重的抗氧化酶。這些酶的活性水平與細胞免疫防御能力密切相關。而Na+-K+-ATPase酶作為生物體內重要的代謝酶，在能量代謝、物質轉運、氧化磷酸化等生化過程中起著重要作用，常作為污染物評價的重要指標[7]。

本研究以黑鯛仔魚為實驗對象，通過檢測被微小亞歷山大藻藻液染毒后仔魚體內SOD酶、GSH酶、Na+-K+-ATPase酶和CAT酶的活性變化，分析微小亞歷山大藻對仔魚抗氧化系統的影響，了解其抗氧化能力及免疫防御水平。以期為評價微小亞歷山大藻對早期魚類生物的生態毒理負面效應提供進一步的實驗依據。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

實驗黑鯛來自江蘇省水產研究所養殖場的親魚直接產的魚卵經孵化四天后的初孵仔魚。實驗用水來源于養殖場經過濾的自然海水，主要鹽度為22。

微小亞歷山大藻藻種(AM-1藻株)由臺灣大學周宏農教授實驗室提供，在實驗室以2 L三角燒瓶f/2培養液單種培養，溫度20±1℃，光照3 000 lx，光暗比12 h∶12 h。選用指數生長期中期的藻液用于實驗。控制實驗溫度為20.2 ℃左右，溫度變幅不超過2.0 ℃，pH為7～8，并保持實驗用水溶解氧為飽和溶氧的60% 以上。

1.2 方法

1.2.1 仔魚的藻液染毒實驗

將藻細胞原液作為母液與過濾海水按一定比例混合稀釋成（約50 000 cell/mL、30 000 cell/mL、15 000 cell/mL、10 000 cell/mL）4個濃度組，同時以過濾海水為對照組，每一個濃度組設3個平行樣本，在每個3 000 mL的白搪瓷盆中投入已經開口的仔魚(卵黃囊已經消失，平均體長約為2.34 mm，體重為0.004 9 g，口唇張開度為0.3 mm)。每個平行樣投放仔魚約300尾左右，充氧氣，每天換水一次（20%），進行投餌（輪蟲）一次，觀測4 d內的生長情況，記錄仔魚生長游動情況、外觀畸形以及死亡數量。每24 h隨機抽取50尾左右保存于液氮容器中，帶回實驗室進行抗氧化系統指標的測定和分析。

1.2.2 抗氧化系統指標測定

分別向仔魚整體加適量4 ℃冰冷雙蒸水,高速組織勻漿機( Polytron, PT2MR 2100) 勻漿, 離心10 min (2 ℃、3 300 r/min) , 取上清液用于酶活力測定。SOD、GSH-PX、CAT以及Na+-K+-ATPase活性測定均采用南京建成生物工程研究所的專用試劑盒進行。SOD活性定義：每毫升組織蛋白在1 mL反應液中SOD抑制率達50時所對應的SOD量為1個SOD活力單位 (U)。GSH-PX活性定義：每0.1 mL組織蛋白在37℃反應5分鐘，扣除非酶促反應作用，是反應體系中GSH濃度降低1 μmol/L為一個活力單位。CAT活性定義：每mg組織蛋白中CAT每秒鐘分解吸光度為0.5～0.55的底物中的CAT相對量為1個CAT的活力單位。Na+-K+-ATPase活性定義：每小時毫克蛋白分解ATP產生1 μmol無機磷的量為一個ATP酶活力單位。

1.3 數據處理

利用SPSS生物統計分析軟件，進行單因素方差分析，檢驗各取樣組間數據的差異顯著性，當P ＜ 0. 05時為差異顯著。

2 實驗結果

2.1 對仔魚的SOD的活性影響

分別對暴露在不同濃度下的藻細胞原液進行4 d的仔魚染毒分析，研究不同暴露時間和不同濃度染毒下SOD酶活力的影響。由圖1可以看出，隨著暴露時間的延長，SOD的活性開始處于增加態勢 (P＜0.05)，到3 d后其活力最強，呈現出明顯的時間-效應關系，但時間超過3 d后其活性又開始出現下降趨勢。與對照組相比，差異性均較顯著（P＜0.01）。此外，我們也看出，在試驗時間進行2 d內，濃度越小其對SOD的誘導性越強，符合劑量—效應關系，但到試驗進行到4 d后，開始表現出抑制作用，濃度越大其抑制作用越明顯，各濃度組與對照組相比其差異性較顯著 (P＜0.05)。

圖1 微小亞歷山大藻對黑鯛仔魚的SOD 酶活力的影響Fig. 1 Effects of Alexandrium minitum on the SOD activity in larvae of Sparus macrocephalus

2.2 對仔魚的GSH-PX的活性影響

經不同濃度的微小亞歷山大 藻細胞原液處理后，仔魚的GSH-PX活性在整個實驗期間發生一定的變化（見圖2）。由圖可以看出，從開始的2 d內，藻液對仔魚的GSH-PX酶產生誘導作用，使得酶活性呈現逐步增加的趨勢，活隨后到3 d以后又逐漸呈現下降趨勢，表現一定的抑制性。這種變化與對照組相比有一定差異，但不十分顯著(P＞0.05)。從各濃度組來看，劑量－反應關系較明顯，濃度越大，受影響作用越明顯。

2.3 對仔魚的CAT的活性影響

黑鯛仔魚在藻細胞原液暴露1 d至2 d后，其CAT酶活性則呈現較明顯地增加，但這種誘導作用持續時間短暫，到試驗進行到3 d后，CAT酶活性則開始逐漸下降（圖3）。據圖3可見，黑鯛仔魚經不同濃度的微小亞歷山大藻藻細胞原液染毒后，其CAT酶活性呈現出一定的劑量-效應關系。對于越高的濃度，仔魚的CAT活性受到抑制作用就越強，但這種抑制作用相對于對照組較顯著（P＜0.05）。

圖2 微小亞歷山大藻對黑鯛仔魚的GSH-PX 酶活力的影響Fig. 2 Effects of Alexandrium minitum on the GSH-PX activity in larvae of Sparus macrocephalus

圖3 微小亞歷山大藻對黑鯛仔魚的CAT 酶活力的影響Fig. 3 Effects of Alexandrium minitum on the CAT activity in larvae of Sparus macrocephalus

2.4 對仔魚的Na+-K+-ATPase的活性影響

微小亞歷山大藻對黑鯛仔魚的Na+-K+-ATPase的活性影響結果見表1。相同時間內，隨著藻液濃度的增加，仔魚的Na+-K+-ATPase的活性呈下降趨勢，表現為受到抑制作用。與對照組相比差異性較顯著，尤其是濃度為50 000 cell/mL時，達到極顯著水平( P ＜0.01)。在同組濃度下，仔魚的Na+-K+-ATPase的活性從試驗開始第一天到第四天均出現不同程度的減少, 表現出時間-效應關系。但對照組（0 cell/mL）的仔魚其Na+-K+-ATPase的活性則在實驗開始的3 d內，呈現逐步增加的趨勢，與實驗濃度組呈現明顯的差異性(P＜0.01)。

表1 各濃度組Na+-K+-ATPase酶的活性水平（單位：μmolPi/mgprot/hour）Tab. 1 Effects of Alexandrium minitum with various concentrations on the activities of ATPase in the larvae of Sparus macrocephalus(μmolPi/mgprot/hour)

3 討論與結論

魚類生物在遭受污染物的脅迫作用時，為了免受自由基傷害，其體內存在的抗氧化防御系統的抗氧化酶的發生活性或含量均會發生變化，這些抗氧化酶主要由SOD酶、GSH-PX酶和CAT酶等[8]。這些酶發生一系列的催化－歧化反應，使得過氧化物還原為氧化物或消除細胞內的氧自由基。當高濃度藻液長時間作用于黑鯛仔魚后，產生了大量的活性氧中間體，超過了機體清除活性氧的能力。其結果是大量活性氧中間體作用于酶蛋白分子的關鍵性氨基酸殘基, 使酶活性受到抑制,使CAT上的2SH巰基氧化成SOS, 從而改變CAT酶的結構, 抑制其活性[9]。因而染毒試驗中，所用的藻液濃度，隨著劑量的增加，黑鯛仔魚體內抗氧化酶系統的酶活性受到的抑制作用就越強。

本實驗表明，在低濃度的微小亞歷山大藻細胞原液（約10 000 cell/mL）脅迫下，黑鯛仔魚體內的SOD酶、GSH-PX酶和CAT酶的活性均呈現先增加后減少的現象，SOD酶的活性峰值出現在染毒后的第3 d，GSH-PX酶和CAT酶的活性則在染毒后的第2 d達到峰值。一些學者在研究水環境污染物的過程中發現，當生物體受到輕度脅迫時,在短期內機體組織的SOD、CAT及GSH-PX等酶的活力往往會升高[10]，本實驗同樣出現了類似的現象。這3種酶所表現出的受短暫時間的誘導作用可能是黑鯛仔魚對微小亞歷山大藻液脅迫的適應階段，通過適應性調節機體的相關生理機能活動，從而增強機體抗氧化防御系統清除活性氧自由基的能力。然而一旦藻液的脅迫程度超過黑鯛仔魚生理機能的適應能力時，就會對仔魚抗氧化系統的功能造成傷害，進而引起其功能水平的下降，最終可能造成活性氧自由基的積累和對細胞膜的損傷,降低生物的適應能力和健康水平,從而啟動一系列的中毒反應[11,12]。因而隨著時間的延續，仔魚體內的SOD、GSH-PX和CAT的活性逐漸下降，證實了機體抗氧化功能可能受到損傷。

許多實驗證明，Na+-K+-ATPase對環境中存在的多種有毒物質敏感，它是這些毒物攻擊的靶點，并且這些毒物對Na-K-ATPase活性的抑制具有濃度和時間的依賴性[12]。在本實驗中，黑鯛仔魚Na+-K+-ATPase酶活性最大值出現在試驗開始的前期和低濃度的染毒組。表現出隨著微小亞歷山大藻染毒濃度的增加或染毒時間的延長，仔魚的Na+-K+-ATPase酶活性逐步下降，表明離子傳遞功能受到了抑制。Na+-K+-ATPase酶作為生物體內重要的代謝酶之一，是細胞膜上主動轉運離子的重要組成部分。可推測仔魚的組織細胞受到損傷，導致細胞膜的生理功能減弱，從而使其體內的能量運輸阻斷，Na+、K+離子運轉減慢，代謝產物大量堆積，酶活性的降低也導致仔魚組織細胞滲透壓調節能力降低[14]。

我們通過實驗可以推測藻毒素所誘導的活性氧脅迫可能是黑鯛仔魚抗氧化酶活性受到影響的主要原因，由此影響體內自由基的代謝平衡，引起魚體的其他生理功能下降。與上述3種抗氧化酶的活性變化相比，Na+-K+-ATPase酶活性對藻液的染毒環境反應更為敏感，與藻液濃度存在明顯的劑量－效應關系，其與上述3種酶的活力變化可以一起作為水體中藻液污染的生物指示器。

致謝：本次實驗得到了江蘇水產所養殖基地、東海水產研究所的繆宇平副研究員、晁敏副研究員、馬繼臻同學的大力支持和幫助，在此表示感謝。

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Effects of Alexandrium minitum on the activities of the antioxidant system and ATPase of larvae of Sparus macrocephalus.

JIANG Mei1, HUANG Shi-lin2, LUN Feng-xia3, XIA Pei-yan4
(1. East China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fisheries Science, Shanghai 200090, China;2. The Second Institute of Oceanography, State Oceanic Administration, Hangzhou 310012, China;3. Shanghai General Hydrological Station，Shanghai 200232, China; 4. Shanghai Ocean University, Shanghai 200336, China)

In this article, we studied the change of superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-PX),peroxidase (CAT) and Na+-K+-ATPase activity of larvae of Sparus macrocephalus exposed to Alexandrium minitum algae liquid. It revealed that Alexandrium minitum algae liquid had obvious induction to the GSH-PX and CAT of larvae of Sparus macrocephalus in the early exposure stage, especially for the first two days. However, it showed inhibition effect in the following experiment after 2 days. Besides, Alexandrium minitum algae liquid showed strong induction effect to SOD for the first 3 days then changed to the inhibition effect. The obvious dose- response link between the concentration of exposed algae solution and the activity of SOD, GSH-PX and CAT showed that the higher the concentration of algae solution, the lower the inhibition and the greater the biological toxicity. However, the strong inhibition of algae solution to Na+-K+-ATPase displayed concentration-response link. The four enzyme’s activity changes of the larvae of Sparus macrocephalus studied in this paper can work as the biological indicator of algae pollution in water.

Alexandrium minitum; larvae; antioxidant system; ATPase

S965.3；Q143

A

1001-6932(2010)04-0427-05

2009-08-28；

2009-11-17

國家重點基礎研究發展規劃“973”項目資助（G2010CB428705）；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金（中國水產科學研究院東海水產研究所）(2007M08)；上海市科委“登山行動計劃”項目 (06dz2015)

蔣玫 (1973－)，女，副研究員，主要從事漁業早期生態研究及海洋環境保護與影響評價。電子郵箱：jiangrose73@sina.com