蛋白轉導結構域修飾小鼠干擾素-γ的研制

胡大強（第三軍醫大學第三附屬醫院藥劑科，重慶市 400042）

蛋白轉導結構域修飾小鼠干擾素-γ的研制

胡大強＊（第三軍醫大學第三附屬醫院藥劑科，重慶市 400042）

目的：制備蛋白轉導結構域修飾小鼠干擾素-γ（PTD-mIFN-γ），為研究PTD-mIFN-γ功能作準備。方法：以質粒pUC19/ mIFN-γ為模板，經3輪聚合酶鏈反應（PCR）擴增編碼PTD-mIFN-γ片段，克隆于質粒pUC19上，測序鑒定正確后構建到pQE80L表達質粒載體中，經BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，利用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和Western blot法檢測表達的目的蛋白，鎳離子-次氨基三乙酸（Ni2＋-NTA）凝膠親和層析純化重組蛋白，酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測PTD-mIFN-γ。結果：PCR擴增得到編碼PTD-mIFN-γ的cDNA，SDS-PAGE和Western blot法分析顯示重組蛋白獲得了高效表達，ELISA法檢測出目的蛋白。結論：成功制備了PTD-mIFN-γ。

蛋白轉導結構域；干擾素-γ；蛋白純化；酶聯免疫吸附實驗

干擾素-γ（Interferon gamma，INF-γ）具有抗病毒、抗腫瘤和調節免疫等作用[1]，臨床已廣泛使用。臨床上人IFN-γ主要用于類風濕性關節炎、抗肝纖維化治療。大量研究[2]顯示IFN-γ對防治尋常疣和皮膚瘢痕增生是有益的，但常規肌肉注射或者靜脈給藥可降低患者依從性，如果能制備成乳膏，直接外用可能將增加其應用范圍。然而，因為IFN-γ的分子量超過1萬，皮膚對其吸收有屏蔽作用，從而限制了IFN-γ在尋常疣、皮膚疤痕增生外用給藥的應用。蛋白轉導結構域（Protein transduction domain，PTD）強大的跨膜遞送功能的發現為克服上述方法中的不足提供了可能。本文選擇PTD作為人Ⅰ型免疫缺陷病毒（HIV-Ⅰ）的反式激活因子（TAT）的11肽[3]（氨基酸序列47～57，YGRKKRRQRRR），采用基因工程技術，將PTD連接于小鼠IFN-γ（mIFN-γ）N端，為進一步研究PTD-mIFN-γ跨皮膚遞送等功能提供基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒和菌株

測序質粒pUC19、pUC19/mIFNγ，表達質粒pQE80L和DH5α菌株，均由第三軍醫大學第三附屬醫院藥理室保存。

1.2 試藥與儀器

Tripure RNA提取試劑（美國Roche公司）；限制性內切酶BamHⅠ和HindⅢ、DNA聚合酶、T4連接酶（大連寶生物公司）；質粒提取試劑盒、DNA片段膠回收和聚合酶鏈反應（PCR）產物回收試劑盒（美國Omega公司）；引物由上海生工公司合成；抗His單抗和鎳離子-次氨基三乙酸（Ni2+-NTA）層析系統（德國Qiagen公司）；異丙基硫代半乳糖苷（IPTG，美國Sigma公司）；小鼠IFN-γ酶聯免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒（晶美生物工程有限公司）。

1.3 引物的設計合成

設計擴增PTD-mIFN-γ引物，上、下游引物分別選用BamHⅠ和HindⅢ兩個酶切位點，引物序列如下：

引物1：5′-TCTAAGCTTTCAGCAGCGACTCCTTTTCC-3′；引物2：5′-GAGACAGCGACGAAGACACGGCACAGTCATT-3′；引物3：5′-GAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGA-3′；引物4：5′-GAGGATCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAG-3′。

1.4 PCR法擴增編碼PTD-mIFN-γ cDNA片段

小量法提取測序正確的pUC19/mIFN-γ質粒作為第1輪PCR擴增模板，第2輪和第3輪PCR擴增模板分別為前一輪PCR產物；下游引物均為引物1分別與上游引物2～4組成3對引物，依次經3輪PCR擴增得到編碼PTD-mIFN-γ片段。PCR反應條件為：94℃、5 min激活熱啟動TaqDNA聚合酶，然后94℃、30 s，63℃、30 s，72℃、1 min，共30個循環，最后72℃延伸10 min。PCR產物純化后經BamHⅠ和HindⅢ內切酶酶切，回收目的片段構建到pUC19質粒，然后轉化感受態DH5α細菌，藍白斑篩選，挑選白斑單克隆接種培養后，小量法提取質粒，進行雙酶切鑒定，對含陽性重組質粒細菌進行測序。

1.5 pQE80L/PTD-mIFN-γ表達載體的構建

將測序正確的pUC19/PTD-mIFN-γ質粒經小量法提取，經BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后瓊脂糖電泳膠回收PTD-mIFN-γ片段，構建于pQE80L，轉化感受態DH5α細菌，氨芐青霉素抗性篩選，挑選轉化單克隆接種培養后，小量法提取質粒，進行雙酶切鑒定陽性克隆。

1.6 蛋白的誘導表達

挑取含重組原核表達載體的單個菌落接種于LB培養液中37℃、225 r·min－1振蕩培養過夜，次日以1%接種到5 mL LB培養液中37℃振蕩培養至吸光度（A600）為0.6時，加IPTG至終濃度為1 mmol·L－1，繼續培養4 h，取上述培養液1 mL，10 000 r·min－1離心1 min，沉淀行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。取含重組原核表達載體的細菌50 mL，誘導表達蛋白，操作同“挑取”至“繼續培養4 h”止，菌液離心后，棄去上清液，超聲碎菌，功率為總功率的28%，工作時間2 s，間隔時間2 s，碎菌16 min。碎菌液10 000 r·min－1、4℃離心15 min，收集上清液和沉淀分別行SDS-PAGE。SDS-PAGE參照《現代分子生物學實驗技術》[4]進行，使用15%的聚丙烯酰胺分離膠和5%濃縮膠，鑒定融合蛋白。

1.7 Western blot法

經誘導的pQE80L/PTD-mIFN-γ/DH5α及pQE80L/DH5α（陰性對照）工程菌行SDS-PAGE后，將凝膠上的蛋白經半干法電轉移至硝酸纖維素膜，麗春紅S染色后標出marker的位置，去離子水洗去膜上的麗春紅S，5%脫脂奶粉室溫封閉，加抗His單抗孵育，洗滌后加辣根過氧化物酶（HRP）標記的第二抗體室溫孵育1 h，洗膜后加3，3-二氨基聯苯胺（DAB）閉光顯色。

1.8 Ni2+-NTA凝膠親和層析柱純化蛋白及蛋白含量測定

將含pQE80L/PTD-mIFN-γ質粒的表達菌株接種于500 mL LB培養中液中進行表達（方法同“1.6”項），離心收集誘導表達后的細菌，Lysis緩沖液（50 mmol·L－1NaH2PO4，300 mmol·L－1NaCl，10 mmol·L－1咪唑，NaOH調至pH 8.0）懸浮細菌，并加入溶菌酶置于冰上30 min后超聲波破碎菌體，離心得到上清液。上清液過Ni2+-NTA凝膠層析柱，用Lysis緩沖液和Wash緩沖液（50 mmol·L－1NaH2PO4，300 mmol·L－1NaCl，20 mmol·L－1咪唑，NaOH調至pH 8.0）洗柱，直至吸光度A280小于0.01，Elution緩沖液（50 mmol·L－1NaH2PO4，300 mmol·L－1NaCl，250 mmol·L－1咪唑，NaOH調至pH 8.0）洗脫目的蛋白。行SDS-PAGE分析，透析純化蛋白。純化的蛋白冷凍干燥后－20℃保存。

冷凍干燥的PTD-mIFN-γ蛋白為白色疏松粉末，蛋白含量測定使用小鼠IFN-γ ELISA試劑盒，采用雙抗夾心ELISA法測定。精密稱取純化蛋白用0.01mol·L－1磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解并稀釋到15～2 000 pg·mL－1濃度范圍內，mIFN-γ ELISA試劑盒測定，操作按試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 PCR擴增編碼

3輪PCR擴增后得到的PTD-mIFN-γ片段，經1.2%瓊脂糖凝膠電泳后顯示在440 bp處有特異擴增條帶，大小與理論值[5]一致，見圖1。

圖11.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PTD-mIFN-γ PCR產物Fig 1 Electrophoresis identification of PCR product of PTD-mIFN-γ in 1.2%agarose gel

測序結果為TATGGCAGGA AGAAGCGGAG ACAGCGACGA AGA CACGGCA CAGTCATTGA AAGCCTAGAA AGCCTGAATA ACTATTTTAA CTCAAGTGGC ATAGATGTGG AAGAAAAGAG TCTCTTCTTG GATATCTGGA GGAACTGGCA AAAGGATGGT GACATGAAAA TCCTGCAGAG CCAGATTATC TCTTTCTACC TCAGACTCTT TGAAGTCTTG AAAGACAATC AGGCCATCAG CAACAACATAAGCGTCATTG AATCACACCT GATTACTACC TTCTTCAGCA ACA GCAAGGC GAAAAAGGAT GCATTCATGA GTATTGCCAAGTTTGAGGTC AACAACCCAC AGGTCCAGCG CCAAGCATTC AATGAGCTCA TCCGAGTGGT CCACCAGCTG TTGCCGGAAT CCAGCCTCAG GAAGCGGAAA AGGAGTCGCT GCTGA，顯示與理論值[5]一致。

2.2 pQE80L/PTD-mIFN-γ重組質粒構建

pQE80L/PTD-mIFN-γ經雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳顯示在440 bp和4.7 kb各有一條帶，證明pQE80L/PTD-mIFN-γ成功構建，詳見圖2。

圖2 pQE80L/PTD-mIFN-γ雙酶切電泳圖Fig 2 Electrophoresis of pQE80L/PTD-mIFN-γ double digested

2.3 重組蛋白的誘導表達

pQE80L/PTD-mIFN-γ質粒的DH5α菌，經IPTG誘導后表達了重組目的蛋白。SDS-PAGE結果顯示，誘導表達的蛋白主要存在于上清液，說明PTD-mIFN-γ主要以可溶性形式存在于細菌中，詳見圖3。

2.4 Western blot法分析結果

經誘導的菌體裂解物與抗His單抗反應，在分子量約1.7×104Da處出現單一條帶，而未經誘導的菌體則無此反應，說明所表達蛋白為PTD-mIFN-γ，詳見圖4。

2.5 蛋白的純化與含量測定

圖3 PTD-mIFN-γ蛋白表達SDS-PAGEFig 3 SDS-PAGE for expression of PTD-mIFN-γ protein

圖4 重組蛋白的免疫印跡分析Fig 4 Western blot analysis of recombinant protein

表達蛋白經Ni2+-NTA凝膠純化后行SDS-PAGE，結果電泳譜中呈單一條帶，說明目的蛋白得到了純較高程度純化，mIFN-γ ELISA試劑盒檢測出PTD-mIFN-γ的含量為39%。SDS-PAGE結果見圖5。

圖5 PTD-mIFN-γ的SDS-PAGE圖Fig 5 SDS-PAGE of PTD-mIFN-γ

3 討論

IFN-γ為Th細胞和自然殺傷（NK）細胞產生的細胞因子，具有抗腫瘤、抗病毒和免疫調節等功能。臨床上可用于類風濕性關節炎治療和抗纖維化治療，抗腫瘤及病毒治療是其研究的新方向。PTD是蛋白轉導過程中能高效穿過膜結構的多肽分子，除可介導蛋白分子、多肽等物質跨越皮膚遞送外，還可高效穿過細胞膜進入到細胞內[6]以及跨越血腦屏障[7]進行物質遞送。PTD與多肽或蛋白質以共價鍵結合，實現藥物跨膜遞送功能。PTD富含堿性精氨酸，α螺旋可使精氨酸殘基構像優化從而增加轉運效率[8]。

小鼠IFN-γ的N末端對蛋白的功能影響較大，PTD/TAT 11肽的位置不影響融合蛋白的功能，所以本文在編碼mIFN-γ cDNA的5′端加上編碼PTD的33個堿基，進而制備PTD-mIFN-γ，重組蛋白的表達菌株選擇大腸桿菌DH5α，大腸桿菌中的細菌酶會特異分解mIFN-γ的C末端，如果PTD構建在mIFN-γ的C端，因融合蛋白的分離純化采用親和層析，標簽His肽在蛋白的N端，制備的蛋白含有未連接PTD的野生干擾素，使目的蛋白不純，進而影響其生物學活性。有關PTD/ TAT構建在mIFN-γ C端的實驗工作已經完成，相關文章已發表[9]。本文采用PCR技術，通過3輪PCR擴增得到編碼PTD-mIFN-γ cDNA片段，易于操作，方便可行。選擇表達載體pQE80L可提高目的蛋白的表達量，并且表達的PTD-mIFN-γ為可溶性蛋白，能保持天然活性。由于表達蛋白N端含有6個His標簽，可用Ni2+-NTA凝膠親和層析柱純化目的蛋白，操作簡便可行。

[1]Smith O，Mayhew E，Reszka R，et al.Antiviral and antiproliferative properties of liposome-associated human interferon-γ[J].J Interferon Res，1990，10（2）：153.

[2]楊靜，李惠.皮損內注射重組人干擾素γ治療尋常疣[J].藥學進展，2006，30（6）：280.

[3]Zhang XY，Dinh A，Cronin J，et al.Cellular uptake and lysosomal delivery of galactocerebrosidase tagged with the HIV Tat protein transduction domain[J].J Neurochem，2008，104（4）：1 055.

[4]盧圣棟.現代分子生物學實驗技術[M].第2版.北京：中國協和醫科大學出版社，1999：379～384.

[5]Gray PW，Goeddel DV.Cloning and expression of murine immune interferon cDNA[J].Proc Natl Acad Sci，1983，80（19）：5 842.

[6]Guelen L，Paterson H，Gaken J，et al.TAT apoptin is efficiently delivered and induces apoptosis in cancer cells[J].Oncogene，2004，23（5）：1 153.

[7]Popiel HA，Nagai Y，Fujikake N，et al.Protein transduction domain-mediated delivery of QBP1 suppresses polyglutamine-induced neurodegeneration in vivo[J].Mol Ther，2007，15（2）：303.

[8]Fan YF，Lu CZ，Xie J，et al.Apoptosis inhibition in ischemic brain by intraperitoneal PTD-BIR3-RING（XIAP）[J].Neurochemistry International，2006，48（1）：50.

[9]胡大強，何鳳田，鄭英如，等.TAT修飾的小鼠IFNγ的制備[J].第三軍醫大學學報，2006，28（8）：795.

Preparation of Protein Transduction Domain Modified Mice IFN-γ

HU Da-qiang（Dept.of Pharmacy，The Third Affiliated Hospital of The Third Military Medical University，Chongqing 400042，China）

OBJECTIVE：To prepare PTD modified mice interferon gamma（PTD-mIFN-γ）in order to prepare for its function research.METHODS：The code of PTD-mIFN-γ fragment was amplified by PCR for 3 times，using pUC19/mIFN-γ as template. The PCR product was cloned into pUC19 plasmid and then constructed into expression plasmid vector pQE80L after sequencing.After double digestion with BamHⅠand HindⅢ，the recombinant vector was identified in 1.2%agarose gel.The target protein and PTD-mIFN-γ was checked by SDS-PAGE，Western blot method and ELISA assay，respectively.Recombinant protein was purified by nikel ion-triglycollamic acid（Ni2＋-NTA）Agarose affinity chromatogram.RESULTS：The cDNA fragment encoding PTD-mIFN-γ amplified by PCR was obtained.The high-level expression of recombinant protein was noted in SDS-PAGE and Western blot assay.The target protein was obtained by ELISA assay.CONCLUSION：PTD-mIFN-γ was prepared successfully.

Protein transduction domain；IFN-γ；Protein purification；ELISA

R 965；R979.5

A

1001-0408（2010）01-0047-03

2009-02-18

2009-04-17）

＊主管藥師，碩士。研究方向：抗腫瘤藥物。電話：023-68898867。E-mail：dph.hdq@163.com