益腎解毒通絡(luò)湯對(duì)糖尿病大鼠腫瘤壞死因子-α的影響

金英花，南 征

(1.廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院，廣東廣州 510080；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，吉林長春 130021)

益腎解毒通絡(luò)湯對(duì)糖尿病大鼠腫瘤壞死因子-α的影響

金英花1，南 征2

(1.廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院，廣東廣州 510080；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，吉林長春 130021)

目的：觀察益腎解毒通絡(luò)湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病腎病的影響。方法：以鏈脲菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠為動(dòng)物模型，經(jīng)益腎解毒通絡(luò)湯10 ml/kg體重（相當(dāng)于30 g生藥/kg）治療12周后，檢測(cè)空腹血糖、HbA1C、血脂、血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白定量，采用放免法檢測(cè)血清TNF-α的表達(dá)水平。結(jié)果：益腎解毒通絡(luò)湯明顯改善DM大鼠的一般狀態(tài)，降低血糖，改善肝功能、腎功能，減少血清中TNF-α水平。結(jié)論：益腎解毒通絡(luò)湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性DM大鼠腎臟有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)糖代謝和脂代謝，改善腎功能，減少尿蛋白排出，降低血清TNF-α水平有關(guān)。

糖尿病腎病；益腎解毒通絡(luò)湯；腫瘤壞死因子-α

糖尿病腎病（DN）屬糖尿病(DM)微血管病變性疾病，是在臨床常見的糖尿病慢性并發(fā)癥。早期表現(xiàn)為尿中排出微量清蛋白，繼之出現(xiàn)臨床蛋白尿，最終進(jìn)展為慢性腎功能不全。研究表明，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和糖尿病腎病的發(fā)生關(guān)系密切。益腎解毒通絡(luò)湯為南征教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方,具有益氣養(yǎng)陰、活血祛瘀、降糖解毒之功效，用于治療消渴腎病氣陰兩虛挾瘀毒證。本實(shí)驗(yàn)著重觀察益腎解毒通絡(luò)湯對(duì)糖尿病大鼠血清TNF-α的影響,為解釋益腎解毒通絡(luò)湯的功效提供現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

藥品：益腎解毒通絡(luò)湯（方劑組成為生地、黃芪、知母、枸杞子、大黃、黃連、陳皮、雙花、榛花、丹參、坤草、土茯苓）由長春中醫(yī)學(xué)院制劑室提供，在水浴中濃縮成3 g生藥/ml濃縮液；陽性對(duì)照藥－吡格列酮，由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供，批號(hào)：國藥準(zhǔn)字H20040631；鏈脲佐菌素(STZ)為Sigma公司產(chǎn)品。

試劑：尿蛋白酶免法試劑盒為上海德波生物技術(shù)有限公司出品；血糖高靈敏試劑盒購自長春生物工程技術(shù)有限公司；血清腫瘤壞死因子試劑盒為解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免研究所出品。

實(shí)驗(yàn)儀器：LD5-2A醫(yī)用離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠產(chǎn)品），UV755B分光光度計(jì)（上海精密儀器有限公司產(chǎn)品），DG-3022A酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（國營華東電子管廠產(chǎn)品），日立7510型生化自動(dòng)分析儀（日本）。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)雄性Wistar大鼠由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物室提供。合格證號(hào)：SYXK(吉)2003-0001號(hào)。

1.2 方法

取雄性Wistar大鼠（體重180～220 g）60只，禁食不禁水12 h，按體重隨機(jī)分為兩組，正常對(duì)照組10只，DM模型組50只。模型組參照文獻(xiàn)方法，采用鏈脲菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病法，單次腹腔注射STZ 50 mg/kg，正常對(duì)照組僅腹腔注射等體積上述緩沖液。注射STZ 72 h后，尾靜脈采血測(cè)定空腹血糖及尿糖。取血糖≥16.7 mmol/L，尿糖+++以上者，再按體重隨機(jī)分為益腎解毒通絡(luò)湯組（15只）、陽性對(duì)照組（15只）和模型對(duì)照組（15只）。于注射STZ后 7 d，中藥實(shí)驗(yàn)組每日上午灌服益腎解毒通絡(luò)湯濃縮液10 ml/kg體重（相當(dāng)于30 g生藥/kg），陽性對(duì)照組每日上午灌服吡格列酮5 mg/kg體重，DM模型組和正常對(duì)照組每日上午灌服等體積飲用水，連續(xù)灌服12周。于服藥終末收集24 h尿量，測(cè)定尿蛋白量。次日將大鼠眼眶采血，檢測(cè)空腹血糖、HbA1c、血脂、血肌酐及尿素氮。血清TNF-α按照試劑盒說明書要求進(jìn)行操作，最后在γ放射免疫計(jì)數(shù)器上測(cè)定放射性。最后，用0.9%NaCl溶液灌洗腎臟，剖取腎臟，濾紙吸干，去掉包膜，即刻稱重。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

正常對(duì)照組的大鼠體重明顯增加，精神狀態(tài)良好，反應(yīng)靈敏，動(dòng)作自如，毛發(fā)平伏有光澤，無一只死亡。DM模型組的大鼠明顯消瘦，多飲、多食、多尿明顯；且精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，動(dòng)作遲緩，毛豎無光澤，弓背蜷體，部分出現(xiàn)爛尾、肢體感染潰爛、白內(nèi)障（6只）等并發(fā)癥，其中有5只因衰竭或出現(xiàn)并發(fā)癥而死亡。吡格列酮組也出現(xiàn)類似表現(xiàn)和并發(fā)癥，但程度較輕，陽性對(duì)照組3只死亡。中藥實(shí)驗(yàn)組大鼠精神狀況、反應(yīng)、毛色較正常組差，但比DM模型組、陽性對(duì)照組好，無合并白內(nèi)障，實(shí)驗(yàn)過程中有3只死亡。

2.2 益腎解毒通絡(luò)湯對(duì)糖尿病大鼠血糖、HbA1c及TNF-α的影響

結(jié)果表明，注射STZ后12周大鼠的血糖、糖化血紅蛋白及腫瘤壞死因子明顯增高，與正常對(duì)照組比較差異明顯。經(jīng)12周治療后，益腎解毒通絡(luò)湯組和吡格列酮組則明顯降低，與模型組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），且其作用強(qiáng)度前者略高于后者，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠12周末空腹血糖、HbA1c、血清TNF-α比較（±s）

表1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠12周末空腹血糖、HbA1c、血清TNF-α比較（±s）

與正常對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與DM模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

正常對(duì)照組DM模型組益腎解毒通絡(luò)湯組吡格列酮組組別 例數(shù)（n）10 10 12 12血糖（mmol/L）5.89±0.49 18.81±3.46**13.74±2.75**##14.16±2.56**##HbA1c（%）3.28±0.52 6.43±1.03**4.30±0.81**##4.70±0.84**##TNF-α（mg/ml）1.57±0.16 3.71±0.43*2.43±0.44*#2.57±0.39*#

2.3 益腎解毒通絡(luò)湯對(duì)糖尿病大鼠TG、TC、血清BUN、Scr的影響

結(jié)果表明，注射STZ后12周大鼠的血脂（TG、TC）明顯升高，腎功能（BUN、Scr）顯著升高，與正常對(duì)照組比較差異顯著。經(jīng)12周治療后，益腎解毒通絡(luò)湯組和吡格列酮組則明顯降低血脂，其中TG降低幅度前者明顯大于后者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；腎功能（BUN、Scr）障礙均明顯改善，且其改善程度前者略高于后者，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠12周末TG、TC、血清BUN、Scr比較（±s）

表2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠12周末TG、TC、血清BUN、Scr比較（±s）

與正常對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與DM模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與吡格列酮組比較，▲P<0.05

組別 例數(shù)（n）TC（mmol/L）正常對(duì)照組DM模型組益腎解毒通絡(luò)湯組吡格列酮組10 10 12 12 1.41±0.32 2.64±0.56**1.90±0.59*##1.96±0.59*##TG（mmol/L）0.66±0.16 1.61±0.32**0.94±0.30*##▲1.26±0.39**#BUN（mmol/L）6.75±0.38 20.16±4.59*11.24±4.04*#12.22±3.63*#肌酐（μmol/L）49.16±9.59 91.42±12.48*68.62±11.07*#70.03±9.76*#

2.4 益腎解毒通絡(luò)湯對(duì)糖尿病大鼠尿蛋白量和腎重量的影響

見表3。注射STZ 12周后大鼠的尿蛋白和腎臟重量明顯增加，與正常對(duì)照組比較差異顯著。益腎解毒通絡(luò)湯和吡格列酮均明顯降低尿蛋白量和腎臟重量，表明該藥對(duì)高糖所致的腎臟微血管損傷有明顯的改善作用。

表3 各組實(shí)驗(yàn)大鼠12周末24 h尿蛋白定量比較（±s）

表3 各組實(shí)驗(yàn)大鼠12周末24 h尿蛋白定量比較（±s）

與正常對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與DM模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

正常對(duì)照組DM模型組益腎解毒通絡(luò)湯組吡格列酮組組別 例數(shù)（n）10 10 12 12尿總蛋白（mg/24 h）13.88±4.15 51.86±20.79*20.19±9.27#21.26±8.53#左腎重（g）0.88±0.15 1.39±0.87**1.03±0.10**##1.12±0.10**##腎重/體重（mg/g）2.75±0.23 7.42±0.32**4.23±0.16**##4.65±0.16**##△

3 討論

研究證明，高血糖所致的非酶糖化蛋白蓄積是引起糖尿病慢性并發(fā)癥的關(guān)鍵因素[1]。糖尿病的非酶蛋白糖基化并非只限于血紅蛋白[2-3]，而是有全身傾向的，若蛋白質(zhì)分子間發(fā)生交聯(lián)形成穩(wěn)定的終末代謝產(chǎn)物（AGEs），易于發(fā)生病理效應(yīng)。糖尿病腎病是糖化蛋白AGEs積聚于腎臟，刺激腎小球系膜細(xì)胞釋放細(xì)胞外基質(zhì)成分，導(dǎo)致腎小球基底膜增厚、肥大、硬化等病理改變。本實(shí)驗(yàn)證明，益腎解毒通絡(luò)湯對(duì)血糖及糖化血紅蛋白的形成有明顯的抑制作用，提示該藥具有預(yù)防腎小球病變的形成或改善其病變的作用。吡格列酮屬胰島素增敏劑，可減少外周組織和肝臟的胰島素抵抗，增加依賴胰島素的葡萄糖的處理，并減少肝糖的輸出。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果它的降血糖及糖化血紅蛋白強(qiáng)度略遜于益腎解毒通絡(luò)湯，這可能是由作用靶點(diǎn)過于局限所致。

TNF-α被認(rèn)為是一種潛在的致纖維化因子，作為炎癥介質(zhì)在炎癥急性期及硬化過程中起重要作用[4]。Nakamura T等[5]發(fā)現(xiàn)DM 4周后，DM小鼠腎小球TNF-α mRNA水平增加2倍，12周后增加3倍，24周后增加4.2倍。研究發(fā)現(xiàn)DN中，血清TNF-α和IL－18明顯升高，并且隨著不同臨床階段而升高，在大量蛋白尿階段最高[6-7]。近來研究證明，腫瘤壞死因子（TNF-α）是導(dǎo)致DN早期腎小球血流動(dòng)力學(xué)異常的主要介質(zhì)[8]，也是高糖時(shí)由晚期糖化終末產(chǎn)物（AGEs）所釋放的另一種因子。它可致使誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）活性增加，一氧化氮（NO）過量產(chǎn)生。過量的NO在DN病理生理過程中起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)表明，益腎解毒通絡(luò)湯和吡格列酮均能降低血清TNF-α，對(duì)腎臟起到一定保護(hù)作用。

DN常發(fā)生脂質(zhì)代謝紊亂，促使腎臟的損傷。故控制脂質(zhì)代謝紊亂也是保護(hù)DN腎臟的關(guān)鍵措施。本實(shí)驗(yàn)又證明，益腎解毒通絡(luò)湯具有一定的調(diào)節(jié)脂代謝作用，能降低DM大鼠TC、TG水平，其中降低TG幅度明顯大于吡格列酮。說明，益腎解毒通絡(luò)湯的改善脂質(zhì)代謝異常、防止腎臟損傷是另一種作用途徑。

蛋白尿及腎臟肥大是DN早期的主要病理效應(yīng)，與之相應(yīng)的病理改變是腎小球基底膜上負(fù)電荷丟失、通透性增加、腎小球系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞等增生，腎組織體積增大。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果,益腎解毒通絡(luò)湯和吡格列酮明顯降低尿蛋白量，腎重/體重比值低于模型對(duì)照組（P<0.01），表明，該藥具有治療糖尿病腎病的直觀依據(jù)。

綜上所述，益腎解毒通絡(luò)湯具有調(diào)節(jié)糖代謝和脂代謝、抑制腎臟肥大、降低血清TNF-α水平和尿蛋白量等作用。該藥是是一種多靶點(diǎn)、多途徑的中藥復(fù)方制劑，對(duì)糖尿病腎病的預(yù)防及治療具有十分重要的意義。

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The effect of Yishen Jiedu Tongluo Recipe on tumor necrosis factor-α in diabetic nephropathy rats

JIN Yinghua1,NAN Zheng2
(1.The First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmaceutical University,Guangdong Province,Guangzhou 510080,China;2.The First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chainese Medicine,Jilin Province,Changchun 130021,China)

Objective:To observe the effect of Yishen Jiedu Tongluo Recipe (YSJDTLR)on tumor necrosis factor-α in diabetic nephropathy rats.Methods:The diabetic nephropathy models of rats(n=60)were produced by inducement of Streptozotocin(50 mg/kg)．The blood glucose,glycol-hemoglobin,TC,TG,BUN,SCR,the level of 24 h Urine protein,tumor necrosis factor-α,and Urine protein were measured at 12 weeks after"YSJDTLR"(10 ml/kg)were treated with rats.TNF-α was measured by methods of radioimmunoassay..ResultsThe blood glucose,glycol-hemoglobin,tumor necrosis factorα,TC,TG,BUN,SCR and Urine protein were decreased after YSJDTLR(10 ml/kg)treatment compared with the DM group.Conclusion:The study suggests that YSJDTLR has protective effect on DM rats.The mechanisms might related to the regulation of glucose metabolism and lipid metabolism,and the improvement of kidney function,also decrease of TNF-α.

Diabetic nephropathy;Yishen Jiedu Tongluo Recipe;Tumor necrosis factor-α

R587.2

A

1674-4721（2010）12（a）-017－03

金英花（1979-），碩士研究生學(xué)歷；廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科。

2010-10-15）