Meox1在心臟過表達引起轉基因小鼠擴張性心肌病

王書美，呂 丹，陳 煒，張 麗，張 偉，張曉娟，曹興水，張連峰

(中國醫學科學院北京協和醫學院實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，北京 100021)

研究報告

Meox1在心臟過表達引起轉基因小鼠擴張性心肌病

王書美，呂 丹，陳 煒，張 麗，張 偉，張曉娟，曹興水，張連峰

(中國醫學科學院北京協和醫學院實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，北京 100021)

目的建立心臟特異表達Meox1轉基因小鼠，研究Meox1對心臟發育及心肌病的調節作用。 方法

利用心臟特異啟動子α－MHC構建轉基因表達載體，顯微注射法建立Meox1轉基因小鼠，PCR鑒定轉基因小鼠的基因型，Western blot檢測Meox1在心臟組織中的表達，心臟超聲檢測轉基因小鼠及野生小鼠的心臟結構和功能。結果在生理狀態下，Meox1基因只在幼鼠心臟中表達，在病理狀態下，Meox1基因在成年心肌病小鼠的心臟組織表達升高。通過顯微注射，建立了兩個Meox1基因在心臟組織的表達水平明顯高于同齡對照小鼠的轉基因小鼠品系。與野生型小鼠相比，兩個Meox1轉基因小鼠品系收縮期左室內徑分別增加7.2%、12.8%(P＜0.01，n =16)，舒張期左室內徑分別增加15.6%、24.2% (P＜0.01，n=16)，收縮期容積分別增加36.8%、65.7%(P＜0.01，n=16)，舒張期容積分別增加18.2%、33.8%(P＜0.01，n=16)。射血分數分別減小6.6%、9.3%(P＜0.05，n=16)，短軸內徑縮短率分別減小9.4%、12.3%(P＜0.05，n=16)。結論Meox1在心肌病心臟中表達，其在心臟高表達引起心臟左室內徑增加，收縮期容積和舒張期容積顯著增大，射血分數及短軸縮短率減少等擴張性心肌病表型，是參與心肌病病理發生的基因之一。

Meox1;轉基因小鼠;心臟;心臟超聲

同源盒蛋白是一組調節組織生長和發育的系統發育保守的轉錄因子［1］。同源盒基因(homeobox gene)是控制發育的主要基因，對動物的器官發生和細胞分化調控起關鍵作用。脊椎動物中同源盒基因家族很大，按一個基因組中10萬個基因，估計超過0.2%的基因含有同源盒［2］。

Meox基因是一類組成非簇生的、分歧的、控制觸角樣的同源異形盒基因的亞家族，包括 Meox1 (mesoderm/mesenchyme homeobox gene1)和 Meox2 (mesoderm/mesenchyme homeobox gene 2)，在中胚層和間充質的大范圍內廣泛表達，編碼的蛋白可能在調節體節發育的分子信號網絡中發揮作用［3－7］。Meox1在形成體節的前體節中胚層、上皮體節、發育中的體節的生骨節和生皮肌節中表達。但在其他正常組織中也觀察到Meox1的表達，包括乳腺和卵巢。Meox2在生骨節，移行至四肢的移行肌原細胞以及四肢的前肌肉區表達［4，7，8］。

Mankoo等［9］報道了同源盒基因 Meox1和Meox2在調節體節形成，圖示發育和分化的幾種遺傳途徑中的協調作用。缺乏Meox1活性的小鼠，其椎骨和肋骨有缺陷，而缺乏 Meox2活性的小鼠，其在四肢肌肉的分化和形態發生中嚴重缺陷。同時缺乏Meox1和Meox2的小鼠缺乏中軸骨骼，并且骨骼肌嚴重缺陷。這些嚴重的缺陷表型表明，體節上皮形成、圖示發育、邊緣的維持、以及生骨節和生皮肌節衍生的細胞分化均需要Meox1和Meox2。

近年來，關于同源盒基因的報道日益增多，然而有關Meox1的研究卻很少，通過組織表達譜推測其對心臟發育及心血管系統可能具有重要的生理作用，本文特建立心臟特異表達 Meox1的轉基因小鼠，以對其生理功能，特別是其對心臟正常發育可能存在的作用的進行初步研究。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

C57BL/6J小鼠購自中國醫學科學院實驗動物研究所，康藍公司XCXK京2004001，ICR小鼠由本實驗室飼養，實驗中涉及動物的操作程序已經得到中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準，批準號為GC－08－2036。

1.2 實驗儀器與試劑

主要儀器:PCR儀(Effendorf)，電泳儀(ATTA)，凝膠 圖 象 分 析 系 統 (Tannon)，循 環 水 浴(Pharmacia)，顯微注射儀(TE2000U)，電磁攪拌器，低溫高速離心機(Beckman)，紫外分光光度計(Amersham)，自動洗片機(Kodak X－OMAT2000)，小動物超聲影像系統(Vevo770)。

主要試劑:Trizol試劑、逆轉錄試劑盒、PCR引物(Invitrogen，美國)，pMD18 T載體、Taq DNA聚合酶、限制性內切酶Sal I和Not I(寶生物工程有限公司，中 國 )，NC 膜 (nitrocellulose membrane，Immobilon NC;Millipore，法國)，羊抗鼠 Meox1蛋白抗體 (Santa Crutz，美國)，辣根過氧化物酶標記的兔抗羊抗體(Pierce Biotechnology，美國)，內參HRP－GAPDH康成生物，中國)。化學發光試劑(Santa Cruz，美國)。

1.3 模型建立及實驗方法

1.3.1 Meox1表達載體的構建及轉基因小鼠的制備:Trizol法提取 C57BL/6J小鼠心臟總 RNA，用RT－PCR法擴增小鼠 Meox1全長 cDNA，將擴增片段插入 pMD18T載體，經測序并比對正確無突變堿基后，以 Sal I酶切回收 Meox1片段，并克隆入 α－MHC啟動子下游構建心臟特異 Meox1表達載體。提取并酶切鑒定質粒正確后，用 Not I將其線性化，SephedexG50柱純化 DNA片段，獲得 α－MHC啟動的 Meox1基因的轉基因片段，注射前將轉基因片段的濃度調整至5 ng/μL，用顯微注射法將線性化的轉基因表達載體注射到 C57BL/6J小鼠的受精卵中，用 ICR小鼠作假孕受體，制備轉基因小鼠［10］。

1.3.2 PCR鑒定 Meox1轉基因小鼠的基因型:轉基因小鼠在出生9～14 d用剪趾法編號，收集剪下的組織，用堿裂解法提取基因組DNA［11］，用PCR法對轉基因小鼠進行基因型檢測。PCR上游引物為:5’－AAAGAGAGGTCAGACAACCAG－3’，下游引物為: 5’－CAGACTTTGACCTGCCGCTC－3’。PCR反應體系20 μL。反應條件:94℃預變性3 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環。Meox1片段為200 bp。

1.3.3 Western Blot:將小鼠脫頸椎處死后，取 100 mg心臟組織加入1 mL預冷的蛋白裂解液，冰上充分研磨，之后冰上靜置30 min，再將組織勻漿于 4℃12 000 r/min離心 30 min，吸取上清即為心臟組織總蛋白。取50 μg蛋白上樣，12% 的SDS－PAGE凝膠電泳，將蛋白轉移到 0.45 μm硝酸纖維素NC膜上。將NC膜放入5% 脫脂奶粉封閉液，室溫下置搖床上封閉1 h，再用 TBST(1:200)稀釋的羊抗鼠 Meox1蛋白抗體，4℃ 雜交過夜。次日，TBST洗3次，每次5 min。將膜轉移到 TBST(1:15000)稀釋的辣根過氧化物酶標記的兔抗羊抗體，室溫雜交1 h，采用HRP－GAPDH作為內參，TBST洗3次，每次5 min。將膜置于化學發光液中，X－ray膠片曝光、顯影及定影。

1.3.4 超聲檢查Meox1轉基因小鼠:選用3月齡的轉基因陽性和同窩陰性小鼠，用三溴乙醇(0.2 mL/ 10g體重)麻醉，脫去心前區的被毛，選用30 Hz的探頭，按 Zhou報道的方法進行心臟超聲影像分析［12］。

1.4 統計學分析

數據SPSS統計軟件處理。先進行數據的方差齊性檢驗，組間比較采用獨立性 t檢驗。計量數據用均數±標準差((x±s)表示。

2 結果

2.1 Meox1基因在小鼠心臟組織中的表達

分別提取出生1周，1月，3月齡野生型小鼠，以及3月齡 cTnTR92Q和 cTnTR141W轉基因小鼠［13，14］的心臟組織總蛋白，用Meox1多克隆抗體進行Western blot分析，Meox1僅在1周齡幼鼠心臟中表達，成年小鼠心臟中不表達(圖1A)，而在心肌病小鼠模型的心臟中表達(圖1B)。

圖1 Meox1基因在小鼠心臟組織中的表達A:Expression of Meox1 gene in the heart of wild type mice at different ages detected by Western blot;B:Expression of Meox1 gene in the heart of cTnTR92Qand cTnTR141Wtransgenic mice detected by Western blotFig.1 Expression of Meox1 gene in the heart tissues

2.2 Meox1轉基因小鼠的建立及基因型檢測

用 RT－PCR法克隆的小鼠 Meox1基因，測序結果表明克隆的 cDNA同已報道的 Meox1序列完全一致(GenBank No.NM_010791.3)，將 Meox1基因插入心臟特異表達的 α－MHC啟動子下游，構建 α－MHC－Meox1轉基因表達載體(圖2A)。用顯微注射法將線性化的轉基因表達載體注射到 C57BL/6J小鼠的受精卵中，轉入受體假孕 ICR小鼠中，小鼠出生14 d提取基因組 DNA，用PCR擴增 Meox1基因200 bp的片段，鑒定Meox1轉基因小鼠的基因型(圖2B)，共得到7只首建鼠，且均可傳代。

圖2 Meox1轉基因載體和轉基因小鼠的PCR鑒定圖A:Meox1 transgenic expression construct;B:Genotyping of Meox1 transgenic mice with PCR.Note:M:DL2000 DNA marker;P:positive control using α－MHC－Meox1 plasmid;N:negative control;W:blank control;1－10:genomic DNA samples from transgenic mice.Fig.2 Meox1 transgenic construct and genotyping of Meox1 transgenic mice with PCR

2.3 Meox1基因在轉基因小鼠心臟中的表達

分別提取 Meox1首建鼠的 F1代陽性轉基因小鼠和同齡陰性對照小鼠心臟組織總蛋白，用 Meox1多克隆抗體進行 Western blot分析，結果顯示42號和46號轉基因陽性小鼠系心臟組織內 Meox1蛋白表達量明顯高于同齡陰性對照小鼠(圖3)。這2個系的小鼠用于繁殖并進行心臟功能分析。

圖3 Meox 1在轉基因小鼠心臟中的表達Note:WT:The wild type mouse control;F042 and F046:The two transgenic lines;GAPDH:Loading normalization.Fig. 3 Expression of Meox1 gene in the heart of transgenic mice

2.4超聲檢查 Meox1轉基因小鼠的心臟幾何構型及心功能

將3月齡的Meox1轉基因小鼠和同窩陰性小鼠進行心臟超聲影像分析(表1)，結果顯示，Meox1轉基因小鼠(Founder 42，Founder 46)收縮期左室內徑(LVID，systolic)分別增加7.2%(P＜0.01，n= 16)和12.8%(P＜0.01，n=16)，舒張期左室內徑(LVID，diastolic)分別增加15.6%(P＜0.01，n= 16)和24.2%(P＜0.01，n=16)，收縮期容積(LV volume，systolic)分別增加36.8%(P＜0.01，n= 16)和65.7%(P＜0.01，n=16)，舒張期容積(LV volume，diastolic)分別增加18.2%(P＜0.01，n= 16)和33.8%(WTBX?P＜0.01，n=16)，射血分數EF(ejection fraction)分別減小6.6%(P＜0.05，n =16)和9.3%(P＜0.01，n=16)，短軸內徑縮短率 FS(fraction shortening)分別減小 9.4%(P＜0.05，n=16)和12.3%(P＜0.05，n=16)。

表1 野生型小鼠和Meox1轉基因小鼠心臟功能和結構的分析Tab.1 The cardiac structure and function analysis of the wild type and transgenic mice

3 討論

同源盒蛋白是一組調節組織生長和發育的系統發育保守的轉錄因子［1］。1984年，McGinnis和Scott等在果蠅控制發育的基因中發現有一些高度保守的序列，這一序列為180 bp，編碼的60個氨基酸被稱為同源結構域 (Homeodomain)，有螺旋－轉角－螺旋(helix－turn－helix)基序(motif)，具有轉錄因子特征。這些基因因此被稱為同源盒基因。隨后，從動物和菌物中又陸續克隆了許多含有同源盒并且與發育有關的基因，這些基因既可以是同源盒基因(結構)，也可以被稱為同源異型基因(功能)。同源盒基因(homeobox gene)是控制發育的主要基因，對動物的器官發生和細胞分化調控起關鍵作用。

脊椎動物中同源盒基因家族很大，按一個基因組中10萬個基因，估計超過0.2%的基因含有同源盒［2］。傳統上同源盒基因分為兩個亞家族，一類是成簇排列在染色體上，并按前后軸(antero－posterior，A－P)方式表達，稱之為 A－P型，即 Hox基因或I類同源盒基因。HOX基因以4個染色體簇為一系列，各個成員有高度的相似性，胚胎發育中這些基因可能在軀體發育模式中發揮作用。另一類是非 A－P型同源盒基因，非成簇排列，而是散布于不同的染色體上，基于序列的相似性分為一系列組(group)，例如:Emx家族、Pax、Msx和 Otx家族的同源盒基因［3］，一般可能參與特異的器官發生。中胚層/間充質同源盒基因Meox1屬于后者。

Meox1是轉錄因子，表達于發育中的體節，對細胞向骨骼肌系分化起重要作用。Helen等［15］在 P19胚胎癌細胞研究發現Gli2、Meox1、Pax3的調節環對中胚層細胞向肌肉細胞分化是必需的，并且對肌形成調節因子(myogenic regulatory factors，MRFs)的表達及向骨骼肌定性是必需的。

心臟中 Meox1首先在10.5 d.p.c心臟的局部區域表達，這些區域包括軀干動脈(其為大動脈和肺動脈的前身)，以及房室墊(形成隔和瓣膜)［3］。這一器官正在復合生長和重組。Meox1雜交信號未在后期妊娠胚胎成型的心臟中發現。在出生后的小鼠中，Meox1基因也在心臟神經嵴衍生的主動脈升部和主動脈弓表達［16］，也在可能在來源于次級心臟區的主動脈根，肺動脈干以及心瓣膜平面結構表達［17］.我們的結果也顯示 Meox1僅在1周齡幼鼠心臟中表達，成年小鼠心臟中不表達(圖1A)。

Peter等［18］于 P19胚胎癌細胞建立Meox1過表達的細胞系，研究發現 Meox1可誘導心臟的形態發生。

盡管有關Meox1的研究已有數篇，但其心臟及心血管系統的生物學功能還是所知甚少。我們發現胚胎期表達的基因Meox1在肥厚型心肌病HCM模型中表達上調(圖1B)，因此建立了心臟特異的Meox1轉基因小鼠。

首建鼠 Founder 42和 Founder 46的后代小鼠PCR檢測結果顯示外源基因能穩定地傳遞到下一代。Western blot結果顯示Meox1基因的表達量在Founder 42和Founder 46轉基因小鼠心臟組織中與野生型小鼠的相比顯著增高，表明成功建立了心臟特異高表達的α－MHC－Meox1轉基因小鼠，Meox1過表達可使心臟發生心腔變大，室壁不變，心臟收縮功能減弱等改變，對心臟的生長發育有影響。因此，心臟特異表達的 Meox1轉基因小鼠的建立，為進一步與心肌病小鼠模型雜交，研究該基因在心肌病發病中的作用提供了工具，為進一步對Meox1在心臟發育和心肌病的發生過程中的生物學功能及可能的機制加以研究，為臨床心血管疾病的治療提供實驗依據。

［1］ Krumlauf R.Hox genes in vertebrate development［J］.Cell，1994，78:191－201.

［2］ Stein S，Fritsh R，Lemaire L，et al.Checklist:vertebrate homeobox genes［J］.Mech Dev，1996，55:91－108.

［3］ Candia AF，Hu J，Crosby J，et al.Mox－1 and Mox－2 define a novel homeobox gene subfamily and are differentially expressed during early mesodermal patterning in mouse embryos［J］. Development，1992，116:1123－1136.

［4］ Grigoriou M，Kastrinaki MC，Modi WS，et al.Isolation of the human MOX2 homeobox gene and localization to chromosome 7p22.1－p21.3［J］.Genomics，1995，22:550－555.

［5］ Candia AF，Wright CV.The expression pattern of Xenopus Mox－2 implies a role in initial mesodermal differentiation［J］.Mech. Dev，1995，52(1):27－36.

［6］ Candia AF，Wright CV.Differential localization of Mox－1 and Mox－2 proteins indicates distinct roles during development［J］. Int J Dev Biol，1996，40(6):1179－1184.

［7］ Mankoo BS，Collins NS，Ashby P，et al.Mox2 is a component of the genetic hierarchy controlling limb muscle development［J］. Nature，1999，400(6739):69－73.

［8］ Mankoo BS，Skuntz S，Harigan I，et al.The concerted action of Meox homeobox genes is required upstream of genetic pathways essential for the formation，patterning and differentiation of somites［J］.Development，2003，130:4655－4664.

［9］ Gordan JW， Ruddle FH. Integration and stable germline transmission of genes injected into mouse pronuclei［J］.Science，1981，214(4526):1244－1246.

［10］ Zhou YQ， Foster FS， Brian JN， et al. Comprehensive transthoracic cardiac imaging in mice using ultrasound biomicroscopy with anatomical confirmation by magnetic resonance imaging［J］.Physiol Genomics，2004，18:232－244.

［11］ Truett GE，Heeger P，Mynatt RL，et al.Preparation of PCR－quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT)［J］.Biotechniques，2000，29(1):52－54.

［12］ 董偉，馮娟，全雄志，等.cTnTR92Q轉基因小鼠肥厚型心肌病模型的建立［J］.中國比較醫學雜志，2008，18(5):5－8.

［13］ 馮娟，董偉，全雄志，等.cTnTR141W轉基因小鼠擴張型心肌病模型的建立［J］.中國比較醫學雜志，2007，17(10):563－567.

［14］ Manak JR，Scott MP.A class act:conservation of homeodomain protein functions［J］.Development Suppl，1994，61－71.

［15］ Helen P，Peter JG，Alan GR，et al.，Disruption of Meox or Gli activity ablates skeletal myogenesis in P19 Cells［J］.J Biol Chem，2004，279:23874－23881.

［16］ Jiang X，Rowitch DH，Soriano P，et al.Fate of the mammalian cardiac neuralcrest［J］.Development，2000，127:1607－1616.

［17］ Waldo KL，Hutson MR，Ward CC，et al.Secondary heart field contributes myocardium and smooth muscle to the arterial pole of the developing heart［J］.Dev Biol，2005，281:78－90.

［18］ Peter JG， Ilona SS. Hedgehog signaling induces cardiomyogenesis in P19 cells［J］.J Biol Chem，2005，280: 21022–21028.

Over-Expression of Meox1 in Heart Tissue Causes Dilated Cardiomyopathy in the Transgenic Mouse

WANG Shu－mei，LV Dan，CHEN Wei，ZHANG Li，ZHANG Wei，ZHANG Xiao－juan，CAO Xing－shui，ZHANG Lian－feng
(Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Heath，Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences，and Comparative Medical Center，Peking Union Medical College，Beijing 100021，China)

ObjectiveTo establish heart－specific Meox1 expression transgenic mice and to investigate its regulatory effect on the development of heart and cardiomyopathy. MethodsThe transgenic plasmid was constructed by inserting the mouse Meox1 gene into the down－stream of α－MHC promoter.The transgenic mice were generated by microinjection.The genotype of transgenic lines was identified by PCR，and the expression levels of the Meox1 gene were detected by Western blot.The pathologic and functional changes of the heart were analyzed by echocardiography. Results The results of Western blot showed that the expression of Meox1 was only detected in the heart of one－week old wide－type mice，but its expression was up－regulated in the adult mice with hypertrophic cardiomyopathy(HCM).The heartspecific transgenic C57BL/6J mice were established and used to analyze its effect on heart byechocardiography.Compared with the wild type mice，both of the two lines of Meox1 transgenic mice showed significantly heart remodeling with increased left ventricular systolic diameter(7.2%or 12.8% ，P＜0.01，n=16)，increased left ventricular diastolic diameter(15.6%or 24.2%，P＜0.01，n= 16)，increased systolic volume(36.8%or 65.7% ，P ＜0.01，n=16)，and increased diastolic volume(18.2%，33.8% ，P ＜0.01，n=16).Compared with the wild type mice，both of the two lines of Meox1 transgenic mice showed weaker heart function with decreased ejection fraction(6.6%or 9.3% ，P＜0.05，n=16)，and decreased fraction shortening(9.4%，or 12.3% ，P＜0.05，n= 16)。Conclusions The Meox1 is expressed during the pathogenesis of cardiomyopathy.Over－expression of Meox1 in the heart of the transgenic mice causes dilated cardiomyopathy.It suggests that Meox1 may be one of modifier genes which enhances pathogenesis of cardiomyopathy.

Meox1;Transgenic Mouse;Heart;Echocardiography

R－33

A

1671－7856(2010)04－0009－05

2009－12－25

衛生部項目，實驗動物和人類疾病動物模型資源擴展(200802036)和十一五新藥專項支持(2009ZX09501－026)。

王書美(1985－)，女，碩士生。E－mail:xiaomeiwang6@163.com.。

張連峰，E－mail:zhanglf@cnilas.org