人宮頸癌細(xì)胞 Hela移植模型腫瘤生長(zhǎng)的熒光分析和卡尺測(cè)量的比較

李小穎,馬春梅,張連峰

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100021)

人宮頸癌細(xì)胞 Hela移植模型腫瘤生長(zhǎng)的熒光分析和卡尺測(cè)量的比較

李小穎,馬春梅,張連峰

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100021)

目的建立穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的人宮頸癌細(xì)胞系,建立移植瘤模型并比較移植模型腫瘤生長(zhǎng)的熒光分析和卡尺測(cè)量的優(yōu)缺點(diǎn)。方法以 Lipofectamine 2000介導(dǎo) chickenβ-actin-GFP-NEO轉(zhuǎn)染人宮頸癌細(xì)胞Hela,經(jīng)梯度濃度 G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)。BALB/cA-nu裸鼠皮下接種 1× 106個(gè)發(fā)光細(xì)胞使其成瘤,利用活體熒光成像系統(tǒng)和游標(biāo)卡尺觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況。結(jié)果獲得了穩(wěn)定表達(dá) GFP的人宮頸癌細(xì)胞株,將其接種到裸鼠體內(nèi)可成瘤。活體熒光成像觀察發(fā)現(xiàn),1至 3周隨著腫瘤體積逐漸增大,平均熒光光子數(shù)逐漸增加;4周時(shí)隨著腫瘤出現(xiàn)明顯壞死,平均熒光光子數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢(shì),而游標(biāo)卡尺測(cè)量結(jié)果顯示腫瘤在 4至 5周仍然不斷的增大。結(jié)論綠色熒光蛋白能夠在人宮頸癌細(xì)胞 Hela中長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá),用綠色熒光蛋白標(biāo)記的人宮頸癌細(xì)胞 Hela建立的裸鼠腫瘤模型可以為人宮頸癌研究提供理想的實(shí)驗(yàn)材料,應(yīng)用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)能夠客觀定量評(píng)價(jià)活的腫瘤細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的生長(zhǎng)情況,而不是腫瘤體積的變化。

人宮頸癌細(xì)胞;裸小鼠;活體熒光成像系統(tǒng);游標(biāo)卡尺

Hela細(xì)胞源自一名美國(guó)婦女的子宮頸癌細(xì)胞,此細(xì)胞株是由正常子宮頸細(xì)胞被一種人類乳突狀瘤病毒 (Human Papillomavirus 18或 HPV18)轉(zhuǎn)型成癌細(xì)胞的,而且和正常子宮頸癌細(xì)胞有許多不同,此細(xì)胞顯角蛋白免疫沉淀染色陽(yáng)性,包含 HPV-18序列,有正常水平的 pRB表達(dá)和 p53的低水平表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)旨在建立穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的人宮頸癌Hela-GFP細(xì)胞系的基礎(chǔ)上,應(yīng)用活體成像技術(shù)動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)及形成瘤體的過(guò)程,比較移植模型腫瘤生長(zhǎng)的熒光分析和卡尺測(cè)量的優(yōu)缺點(diǎn),為腫瘤模型的測(cè)量和藥物研究提供更方便的分析技術(shù)和實(shí)驗(yàn)材料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器:Hela癌細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)室凍存,L-谷氨酰胺 (G IBCO公司)、雙抗 (G IBCO公司)、DMEM(G IBCO公司)、胎牛血清 (G IBCO公司)、G418(AMRESCO公司)、Lipofectamine 2000 Reagent (I

NV ITROGENE公司)。Whole-body optical imaging system(I.C.E.,日本 Roper公司)、倒置熒光顯微鏡(OLY MPUS IX71)、倒置顯微鏡 (Nikon TS100)。細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒 (in situ cell death detection kit,POD)為 ChemiconInternational公司產(chǎn)品。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:BALB/cA-nu裸小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司 [XCXK(京)2007-0001],鼠齡 5周,體重 15～18 g,在本實(shí)驗(yàn)室無(wú)特定病原體 (specific-pathogen free,SPF)的飼養(yǎng)間飼養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)操作程序均經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用管理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)為 GC-09-2001)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):用含 10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素,100μg/mL鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)基作為Hela細(xì)胞的培養(yǎng)液,于 5%CO2,37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 構(gòu)建帶有篩選標(biāo)記的載體:chickenβ-actin-GFP由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[1,2]。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和篩選:采用 Lipofectamine 2000 Reagent轉(zhuǎn)染 Hela細(xì)胞 (具體轉(zhuǎn)染步驟參照Lipofectamine 2000 Reagent操作說(shuō)明)。轉(zhuǎn)染后 24 h,用含 500μg/mL G418的培養(yǎng)液篩選細(xì)胞 3周,獲得穩(wěn)定表達(dá) GFP的細(xì)胞株,選擇其中高表達(dá)的克隆株擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.4 腫瘤細(xì)胞的植入及活體熒光成像:收集處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的轉(zhuǎn)染細(xì)胞,稀釋至 5×106/mL。各取三只BALB/cA-nu裸鼠進(jìn)行皮下接種,1×106個(gè)細(xì)胞/只,每隔一周觀察一次,飽和三溴乙醇 (0.18 mL/10g)麻醉后放入活體熒光影像系統(tǒng)攝像,Slide Book 4.0軟件進(jìn)行分析。

1.2.5 腫瘤體積的測(cè)定:在接種的 14、21、28和 35 d,分別用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤塊 3個(gè)互相垂直直徑A、B、C,代入下式計(jì)算腫瘤塊的體積 V∶V=1/ 6πABC(V為體積,A、B、C為瘤體的 3個(gè)互相垂直的直徑),并繪制腫瘤的生長(zhǎng)曲線。

1.2.6 腫瘤組織的 H-E和 TUNEL染色:腫瘤生長(zhǎng)5周后,剝?nèi)〕鲆浦擦?制成石蠟切片并進(jìn)行 H-E和TUNEL染色。TUNEL染色步驟:(1)切片經(jīng)二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化;(2)20 mg/L蛋白酶 K消化液作用 15 min;(3)含 3%過(guò)氧化氫的 PBS,于室溫反應(yīng) 5 min;(4)TUNEL反應(yīng)液,37℃孵育 60 min;(5)過(guò)氧化物酶連接的抗熒光素抗體,37℃孵育 30 min; (2)～(5)步后均以 10 mmol/L PBS(pH 7.4)振洗 3次,每次 5 min;(6)DAB顯色,蘇木素復(fù)染,脫水透明,封片。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定高表達(dá) GFP的單克隆細(xì)胞株

穩(wěn)定高表達(dá) GFP的細(xì)胞,在熒光顯微鏡下均呈強(qiáng)熒光,并且熒光較均勻的分布于整個(gè)細(xì)胞內(nèi)。單克隆 GFP細(xì)胞在無(wú) G418篩選壓力下,傳代數(shù)次后仍能穩(wěn)定高水平表達(dá) GFP(圖 1見彩插 2)。細(xì)胞形態(tài)和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞無(wú)明顯區(qū)別。

2.2 GFP熒光標(biāo)記 Hela異種移植瘤模型的動(dòng)態(tài)觀察

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 GFP標(biāo)記的 Hela腫瘤細(xì)胞皮下接種于 3只 BALB/cA-nu,1×106/只。在接種的7、14、21、28和 35d觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況 (圖 2見彩插 2)。1周時(shí)腫瘤大小不能用游標(biāo)卡尺測(cè)量,2周時(shí)腫瘤進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,至 5周時(shí)移植瘤體積可達(dá)474.08 mm3,3周時(shí)動(dòng)物皮膚表面都出現(xiàn)了不同程度的壞死。應(yīng)用小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng)可監(jiān)測(cè)到綠色熒光蛋白在裸小鼠皮下的穩(wěn)定表達(dá),從第 1周至第 3周,隨著腫瘤移植時(shí)間的增加,表達(dá)綠色熒光蛋白的面積逐漸增大,熒光光子數(shù)也逐漸增加,移植瘤體積與熒光光子數(shù)成正相關(guān)。4周后,由于動(dòng)物的皮下腫瘤出現(xiàn)了壞死,因此盡管腫瘤體積仍在增加但平均熒光光子數(shù)反而呈下降趨勢(shì),移植瘤體積與熒光光子數(shù)不再有相關(guān)性(圖 3)。

圖 3 Hela移植模型腫瘤生長(zhǎng)的熒光分析和卡尺測(cè)量的比較Fig.3 The comparison of the tumor growth in implanted mouse model detected by optical imaging system and slide caliper

2.3 H-E和TUNEL染色結(jié)果

H-E染色可見部分腫瘤細(xì)胞核染色質(zhì)勻細(xì),核漿比例大,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,處于分裂期的細(xì)胞很少,腫瘤生長(zhǎng)速度緩慢。另外,大部分細(xì)胞呈現(xiàn)核皺縮、濃染,胞質(zhì)致密、嗜酸性染色增強(qiáng)(圖 4A)。

腫瘤組織經(jīng) TUNEL染色,核呈棕黃色,核固縮,染色質(zhì)凝集成塊狀或邊集,呈現(xiàn)細(xì)胞凋亡的特征(圖 4B)(圖 4見彩插 3)。

3 討論

子宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一,在全球范圍內(nèi),每年約有 20多萬(wàn)女性死于宮頸癌。目前宮頸癌的治療方法主要是手術(shù)和放療,手術(shù)療法原則上限于早期患者,且手術(shù)后容易復(fù)發(fā);放射治療適用于各期浸潤(rùn)型宮頸癌,但放射線缺乏選擇性,對(duì)人體正常細(xì)胞也會(huì)造成傷害,多次放化療以后,患者免疫功能下降,抵抗力降低,容易轉(zhuǎn)移。所以尋找理想的治療方法是當(dāng)務(wù)之急。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要集中于各種抗癌藥物的體外抗宮頸癌研究[3-7],由于缺少理想的腫瘤模型,在體抗宮頸癌報(bào)道很少。張曉茗[8]建立了 Hela細(xì)胞裸鼠移植模型,觀察了大蒜素對(duì)裸鼠移植瘤的影響。腫瘤大小的測(cè)定采用的是傳統(tǒng)的游標(biāo)卡尺測(cè)量方法,此方法簡(jiǎn)單易行,但是早期不敏感,在接種后 2周或更長(zhǎng)時(shí)間才能測(cè)量,并且人為的實(shí)驗(yàn)誤差大,在腫瘤出現(xiàn)壞死后,腫瘤的體積不再代表腫瘤活細(xì)胞的多少和生長(zhǎng)情況。活體生物熒光成像技術(shù) (in vivo bioluminescence imaging)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)分子、基因表達(dá)的分析檢測(cè)系統(tǒng),通過(guò)對(duì)同一組實(shí)驗(yàn)對(duì)象在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行記錄,跟蹤同一觀察目標(biāo) (標(biāo)記細(xì)胞及基因)的移動(dòng)及變化,所得的數(shù)據(jù)更加真實(shí)可信。因其操作極其簡(jiǎn)單、所得結(jié)果直觀、靈敏度高等特點(diǎn),在剛剛發(fā)展起來(lái)的幾年時(shí)間內(nèi),已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及藥物開發(fā)等方面[9-12]。

本實(shí)驗(yàn)在成功建立表達(dá)綠色熒光蛋白的人宮頸癌細(xì)胞系 Hela-GFP的基礎(chǔ)上,將 Hela-GFP細(xì)胞接種于裸鼠,通過(guò)連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察人宮頸癌細(xì)胞在裸小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)情況,發(fā)現(xiàn)成像系統(tǒng)在腫瘤皮下移植7 d時(shí)就可以檢測(cè)到熒光的表達(dá),此時(shí)按傳統(tǒng)方法尚無(wú)法測(cè)量移植瘤體積。隨著移植瘤體積的不斷增加,成像系統(tǒng)可以通過(guò)腫瘤組織釋放的平均光子數(shù)客觀地描述腫瘤的生長(zhǎng),在腫瘤的早期,所得數(shù)據(jù)與游標(biāo)卡尺測(cè)量的腫瘤體積相對(duì)應(yīng)。至 4周后瘤體出現(xiàn)壞死以后,盡管游標(biāo)卡尺測(cè)量的腫瘤體積仍在增加,但成像系統(tǒng)所測(cè)的熒光光子數(shù)反而呈現(xiàn)下降趨勢(shì),利用 HE染色和標(biāo)記凋亡細(xì)胞的 TUNEL染色進(jìn)一步證實(shí),4周后,位于腫瘤組織中心部分已經(jīng)壞死,與活體熒光成像系統(tǒng)觀察結(jié)果一致,說(shuō)明只有活的腫瘤細(xì)胞才能表達(dá) GFP而產(chǎn)生熒光,利用活體成像系統(tǒng)可以只測(cè)量活腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)情況,從而更準(zhǔn)確地反映腫瘤生長(zhǎng)以及與機(jī)體的相互作用。

本實(shí)驗(yàn)成功建立了人宮頸癌細(xì)胞 Hela綠色熒光標(biāo)記的腫瘤模型,此熒光蛋白癌癥模型可應(yīng)用于癌癥體內(nèi)用藥的療法中。利用無(wú)創(chuàng)傷活體熒光成像對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的檢測(cè),可對(duì)癌癥實(shí)驗(yàn)治療之前和過(guò)程中的癌細(xì)胞的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)和評(píng)估。這種方式提供一個(gè)早期、快速、動(dòng)態(tài)觀察癌細(xì)胞的治療反應(yīng)和復(fù)發(fā)評(píng)估的預(yù)診斷途徑,為宮頸癌的研究和相關(guān)藥物研究提供了更準(zhǔn)確的、更方便的測(cè)量技術(shù)和相應(yīng)的動(dòng)物模型。

[1] 馮娟,高苒,全雄志,等.紅色熒光和綠色熒光轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2007,15(4):267-270.

[2] 李小穎,高凱,劉學(xué)麗,等.人結(jié)腸腺癌細(xì)胞 HCT-8綠色熒光標(biāo)記腫瘤模型的建立[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2009,19(7): 19-22.

[3] 譚忠偉,江振友,岳磊,等.復(fù)方中藥對(duì)人宮頸癌 Hela細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響[J].國(guó)際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào),2009,15(9):5-8.

[4] 王惠蘭,張賀玲,黃向華,等.米非司酮對(duì)人宮頸癌 Hela細(xì)胞體外作用的研究 [J].中國(guó)綜合臨床,2006,22(9):853-855.

[5] 劉芳,楊翠軍,孫黎,等.五加皮多糖對(duì)人宮頸癌 Hela細(xì)胞凋亡作用的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2009,20(5):1178-1179.

[6] Bhutia SK,Mallick SK,Maiti S,et al.Abrus abrin derived peptides induce apoptosis by targetingmitochondria in HeLa cells [J].CellBiol Int,2009,33(7):720-727.

[7] Yan Q,Li Y,Jiang Z,et al.Antiproliferation and apoptosis of human tumor cell lines by a lectin(AMML)of Astragalus mongholicus Phytomedicine[J].Phytomedicine,2009,16(6): 586-593.

[8] 張曉茗.宮頸癌Hela細(xì)胞裸鼠移植瘤模型的建立及大蒜素對(duì)移植瘤的影響[D].中國(guó)學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù),2005.

[9] 儲(chǔ)軍,陳延平,熊濤,等.GFP標(biāo)記的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的整體熒光成像[J].激光生物學(xué)報(bào),2004,13(6):433-438.

[10] 高苒,劉學(xué)麗,馮娟,等.熒光標(biāo)記技術(shù)在腫瘤模型研究中的應(yīng)用[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2008,18(5):59-61.

[11] 王勇,馮敢生,田惠,等.原位肝腫瘤血管生成及自發(fā)轉(zhuǎn)移的熒光成像[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2007,87(46):3307-3309.

[12] 吳元東,譚萬(wàn)龍,謝毅,等.人膀胱腫瘤細(xì)胞的熒光標(biāo)記及其移植模型的整體熒光成像[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2006,26 (4):436-440.

The Comparison of Tumor Growth in the I mplantedM ouseM odel Detected by Optical I maging System and a Slide Caliper

L IXiao-ying,MA Chun-mei,ZHANGLian-feng
(KeyLaboratory of Human Diseases ComparativeMedicine,Ministry of Health;Institute ofLaboratoryAnimal Science,Chinese Academy ofMedical Sciences(CAMS)&ComparativeMedicine Centre, PekingUnionMedical Collage(PUMC),Beijing 100021,China)

ObjectiveTo establish a human cervical carcinoma cell line with stable expression of green fluorescent protein and the fluorescent-labeled implanted tumormodel,and compare the detection methods of tumor growth by optical imaging system and slide caliper.M ethod Human cervical carcinoma cells were transfected with chickenβactin-GFP-NEO byLipofectamine 2000 reagent and screened with G418 to produce the stable GFP-expressing clone.Then the labeled Hela cellswere implanted into the subcutaneous tissue of nude mice and the growth of the implanted tumorwas observed and growth curve of the labeled Hela cellswas analyzed with the whole-body optical imaging system and the slide caliper.Result The stable GFP-expressing Hela cell lines were obtained,which can grow to tumor mass after subcutaneous transplantation.The in vivo fluorescence imaging analysis showed that the fluorescent intensity of tumormass increased with the increase in tumor volume in nude mice during first to third week.The fluorescent intensity tended todecline with the increasing necrosis at the fourth to fifth week,while the tumor volume was still increasing。ConclusionA GFP-labeled Hela cell line and a mouse tumormodel based on the cell linewere established,and the animalmodelprovides useful experimental materials for cervical cancer study. The in vivo fluorescence imaging system could be used to quantitatively evaluate the living tumor cell growth in vivo but not the size or volume of the tumor detected by slide caliper.

Human cervical carcinoma;Nude mouse;Whole-body optical imaging system;Slide caliper

R541

A

1671-7856(2010)01-0015-04

2009-09-15

衛(wèi)生部行業(yè)基金,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人類疾病動(dòng)物模型資源擴(kuò)展(200802036)和十一五新藥專項(xiàng)支持(2009ZX09501-026)。

李小穎,助理研究員,主要研究方向:人類疾病動(dòng)物模型。

張連峰。E-mail:zhanglf@cnilas.org