長期施用糞肥土壤中喹諾酮類抗生素的含量與分布特征

邰義萍,莫測輝*,李彥文,2,吳小蓮,鄒 星,高 鵬,黃顯東(.暨南大學環境工程系,廣東省高校水土環境毒害性污染物防治與生物修復重點實驗室,廣東 廣州 50632；2.暨南大學水生生物研究所,廣東 廣州 50632)

長期施用糞肥土壤中喹諾酮類抗生素的含量與分布特征

邰義萍1,莫測輝1*,李彥文1,2,吳小蓮1,鄒 星1,高 鵬1,黃顯東1(1.暨南大學環境工程系,廣東省高校水土環境毒害性污染物防治與生物修復重點實驗室,廣東 廣州 510632；2.暨南大學水生生物研究所,廣東 廣州 510632)

針對珠江三角洲地區長期施用糞肥的“無公害蔬菜”生產基地,利用固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)分析方法,探討了土壤中喹諾酮類(QNs)抗生素4種化合物的含量與分布特征.結果表明,土壤中4種化合物的總含量(ΣQNs)為3.97～32.03μg/kg,平均17.99μg/kg.各化合物的檢出率除了洛美沙星(92%)以外均為100%,最高含量為17.21μg/kg,平均含量為0.17～9.31μg/kg,以環丙沙星為主,其次是諾氟沙星和恩諾沙星.化合物的含量與組成特征無論在平面上還是在剖面上均存在明顯的空間分布差異,且隨著深度增加含量迅速降低,但在80cm深度仍有檢出.珠江三角洲地區長期施用糞肥蔬菜基地土壤中喹諾酮類抗生素含量較低,土壤生態毒性風險較小,但各化合物均很高的檢出率而導致的協同生態毒性尤其是耐藥性問題值得進一步研究.

土壤；糞肥；喹諾酮類抗生素；污染

Abstract：The concentration and distribution of quinolone antibiotics in soil of vegetable field chronically fertilized with manures was studied using solid-phase extraction followed by high-performance liquid chromatography- electrospray ionization tandem mass spectrometry. The total concentrations of four quinolone compounds ranged from3.97 to 32.03μg/kg with an average of 17.99μg/kg. There were very high detection rates (above 90%) observed for four compounds which dominated mostly with ciprofloxacin and secondly with norfloxacin and enrofloxacin. The concentrations of these compounds were all comparatively lower, with maximum concentration of 17.21μg/kg and average concentrations of 0.17～9.31μg/kg. There was obvious difference in spatial distribution of concentration and constitute of quinolone compounds in both horizontal and profile soil. All four compounds decreased rapidly with soil depth, but they were still detected at soil depths between 60 and 80cm. Quinolone antibiotics in soils from vegetable field chronically fertilized with manure in subtropical area were high frequently detected, but the concentration of them was comparatively lower and the ecotoxic risk was less owing to high degradation of antibiotics under hot and humid climate and heavy cultivation.

Key words：soil；manures；quinolone antibiotics；pollution

規模化畜禽養殖中大量使用喹諾酮類、四環素類和磺胺類等各種抗生素[1-2].抗生素使用后通常大部分以藥物原形或其代謝物隨糞尿排出[3],造成動物糞便中抗生素的含量普遍較高,甚至高達數十mg/kg以上[4-9],成為環境中抗生素的重要來源.而且,規模化畜禽糞便廣泛作為有機肥料大量施用于農業生產,造成土壤抗生素殘留污染[5-7,10-12],其輸入量甚至不亞于農藥施用量[4],并通過干擾土壤微生物的群落結構與功能[12-13]而影響土壤肥力,也可被作物吸收累積[14-15]而危及農產品質量安全.此外,土壤抗生素污染還可通過地表徑流和淋濾作用造成水體的抗生素污染[16-18],并引發細菌耐藥性[19],威脅動物與人類健康.因此,抗生素已成為一類重要環境有機污染物和環境科學研究的熱點,但研究工作主要集中在水環境污染及其生態效應方面[16-18,20],而對于土壤環境污染及其生態效應的研究較少[5-7,12-13],我國相關報道較少[10-12].富含抗生素的規模化畜禽糞便長期施用而導致的土壤抗生素污染,污染狀況與抗生素種類、氣候條件、生產方式等各種因素密切相關.本研究針對畜禽養殖中廣泛使用的喹諾酮類(QNs)抗生素,探討珠江三角洲地區長期施用糞肥的“無公害蔬菜”生產基地土壤中4種喹諾酮類化合物的含量與分布特征,為糞肥安全施用和土壤抗生素污染控制提供科學依據.

1 材料與方法

1.1儀器與試劑

固相萃取裝置(VisiprepTM-DL,Supelco)、Oasis HLB固相萃取柱(3mL/60mg,Supelco)、數控恒溫水浴、恒溫震蕩器、超聲波清洗器、低速離心機,以及高效液相色譜(Agilent1100)、電噴霧(ESI)離子源串聯質譜儀(AB4000QTRAP).

喹諾酮類(QNs)抗生素4種化合物分別為諾氟沙星(NOR)、環丙沙星(CIP)、洛美沙星(LOM)、恩諾沙星(ENR),其標準品均購自德國Ehrenstorfer GmbH公司,純度大于98%.甲醇、乙腈均為色譜純(Sigma公司),其他化學試劑均為分析純,實驗用水為高純水.喹諾酮類化合物標準品母液:準確稱取0.0100g標準品溶于少量乙酸溶液,用乙腈/水(20/80,V/V)稀釋定容至100mL,配制成濃度為100μg/mL的標準品儲備液,在4℃下避光保存.實驗中各種濃度的標準品工作液均用乙腈/水(20/80,V/V)按一定比例稀釋得到.校正曲線工作液濃度范圍為0.001～0.5μg/mL.50%硝酸鎂溶液:50gMg(NO3)2·6H2O溶于100mL水,可提前配制,室溫保存.10%氨水溶液:按10mL25%氨水加入100mL水的比例配制,現配現用.

1.2樣品采集與預處理

研究區為地處亞熱帶濕熱氣候條件(年均氣溫21.9,℃年降雨量1682.8mm)的珠江三角洲地區某現代化農業生態園區內“無公害蔬菜”生產基地,面積約1000500m2,由企業(連片66700m2以上)或各農戶(6670m2/戶左右)經營,以北江清潔水源灌溉,長期施用畜禽糞肥作為有機肥(每年約0.4kg/m2),同時施用一定量化肥.土壤母質為河流沖積物,土壤類型為水稻土,質地多為砂土或砂壤土.

根據生產方式、蔬菜品種和環境條件等因素,按環境監測要求選擇13個采樣地塊,分別以多個點位采集表層土壤(20cm)組成混合樣.同時對大白菜和苦麥菜菜地分別采集土壤剖面樣品(0～20, 20～40,40～60,60～80cm).樣品采集后按四分法縮減,于室內冷凍干燥后粉碎過60目篩備測,其中表層土壤樣品13個,2個不同蔬菜土壤剖面樣品各4個.表層土壤pH值為弱酸性,隨著深度向中性演化.樣品預處理方法參考文獻[21]進行.準確稱取1.00g土壤樣品置于10mL離心管中,加入50%硝酸鎂-10%氨水(96/4,V/V)4mL,振蕩5min,超聲提取15min,離心(4500r/min)8min,收集上清液.殘渣用上述方法反復提取2次.合并上清液,再過HLB固相萃取小柱(先后過6mL甲醇和6mL水)萃取富集.用6mL高純水清洗小柱,真空干燥10min,再用3mL乙酸-乙腈(1/99, V/V)洗脫小柱.洗脫液在40℃水浴下用氮氣吹至近干,用乙腈-水(20/80,V/V)定容至1mL,溶液過0.22μm濾膜收集于樣品瓶中待測.

1.3LC-MS/MS分析

LC-MS/MS分析條件參考文獻[22].色譜條件:色譜柱為Ailent Eclipse Plus C18(5μm, 2.1mm×150mm);柱溫20;℃柱平衡時間30min;流動相為水(含1%甲酸)-乙腈(含1%甲酸)(80/20, V/V;),流速為0.2mL/min;進樣量5μL.質譜條件:離子化模式為ESI(+);霧化氣為60psi;干燥氣為50psi;氣簾氣為20psi;離子源電壓5500V;去溶劑溫度600℃;碰撞氣壓水平為高壓.

1.4質量控制與質量保證

以喹諾酮類抗生素的脫羧離子([MH-CO2]+)為定量離子.喹諾酮類抗生素4種化合物的加標回收率在54.8%～76.5%之間(表1),相對標準偏差(RSD,n=3)均低于1%.以混合標準品工作液系列濃度為1.0,10.0,50.0,100.0,500.0μg/L,建立各化合物標準曲線的線性回歸方程,并根據1.0μg/L混合標準品工作液色譜峰,按3倍信噪比計算方法檢測限,按10倍信噪比計算樣品定量限(表1).為控制實驗過程中人為污染,保證操作過程準確,每10個樣品間隔設置空白樣、樣品平行樣、樣品加標樣,并且在進樣時以固定濃度標樣進行質量控制.空白樣中未檢出喹諾酮類化合物,平行樣檢測結果相對標準偏差均＜5%.整個分析流程諾氟沙星、環丙沙星、洛美沙星和恩諾沙星的回收率分別為67.5%～82.5%、56.8%～78.2%、66.3%～77.1%和65.6%～73.2%.

表1 土壤中喹諾酮類化合物的回收率、檢測限與定量限Table 1 Recovery, limit of detection, limit of quantification of quinolone antibiotics in soil

2 結果與討論

2.1表層土壤中喹諾酮類抗生素的含量

研究區為“無公害蔬菜”生產基地,以清潔江水進行灌溉,因此土壤中抗生素主要來源于糞肥的施用.由表2可見,表層土壤中喹諾酮類抗生素4種化合物總含量為3.97～32.03μg/kg,平均17.99μg/kg,＜10μg/kg與20～30μg/kg的樣品各占30.8%和30.7%,10～20μg/kg與＞30μg/kg的樣品分別占23.1%和15.4%.諾氟沙星、環丙沙星和恩諾沙星的檢出率均為100%,其含量范圍分別為0.52～13.13,2.90～17.21,0.55～15.46μg/kg,平均含量分別為4.98,9.31,3.52μg/kg.洛美沙星的檢出率為92%,且其中大部分(76.9%)低于定量限,最高含量僅為1.96μg/kg.因此,表層土壤中喹諾酮類化合物組成以環丙沙星為主,其次為諾氟沙星和恩諾沙星,而洛美沙星的含量很低.

表2 表層土壤中喹諾酮類抗生素的含量(μg/kg)Table 2 Concentrations of quinolone antibiotics in top soils (μg/kg)

雖然研究區長期施用糞肥土壤中喹諾酮類化合物的檢出率高達90%以上,但各化合物平均含量均低于10μg/kg,最高含量均低于20μg/kg,也低于土耳其、澳大利亞等施用糞肥土壤中喹諾酮類化合物的含量[6-7].影響施用糞肥土壤中抗生素的含量與環境行為的因素很多,包括抗生素種類、氣候條件、土壤特性、土地利用方式、耕作方式(如種植、施肥、灌溉)等.通常磺胺類抗生素在糞肥中的含量較高,而在施用糞肥土壤中的含量較低,但喹諾酮類和四環素類抗生素的情況則相反[7];施用糞肥本身尤其是糞肥施用量越大、連續施用以及在濕、熱氣候條件下施用了均有利于土壤中抗生素的降解,從而降低土壤污染程度[23-27].這是研究區長期施用糞肥土壤中抗生素的含量甚至比一般農業土壤如東莞市普通蔬菜生產基地土壤中抗生素含量更低的重要原因,一般農業土壤中抗生素的含量可來源于灌溉水等途徑[28].另外,類似于土壤中有機污染物的植物修復作用一樣[29],在蔬菜生產中較高的復種指數和經常性的輪作也有利于施用糞肥土壤中抗生素的降解而減輕污染程度,這也可能是研究區土壤中喹諾酮類抗生素含量低于土耳其、澳大利亞等施用糞肥土壤中喹諾酮類化合物含量的重要原因[6-7].根據獸藥國際協調委員會(VICH)籌劃指導委員會關于抗生素產生生態毒性效應的閾值100μg/kg進行生態風險評估[7],研究區土壤中喹諾酮類化合物及其總含量均低于該值,生態毒害風險較小,但各化合物之間的聯合毒性以及耐藥性問題需要進一步研究.

2.2不同植物土壤中喹諾酮類抗生素的含量與組成特征

圖1 不同植物土壤中喹諾酮類抗生素特征Fig.1 Occurrence of quinolones in soils grown differentspecies of vegetables

種植不同植物土壤中喹諾酮類化合物的含量及組成特征差異明顯(圖1).4種喹諾酮類化合物的總含量以苦麥菜土壤中的最高(31.19μg/kg),其次是西蘭花和香蕉土壤(22.68～22.71μg/kg)以及大白菜、菜心、韭菜和油麥菜土壤(12.95～16.80μg/kg),而蔥、蘿卜土壤中的最低(7.33～9.18μg/kg),最高與最低之間相差4倍以上.從單個化合物的含量與組成特征來看,苦麥菜土壤中以環丙沙星和恩諾沙星為主,西蘭花土壤中以諾氟沙星、環丙沙星和恩諾沙星為主,香蕉、大白菜、菜心、韭菜、油麥菜和蔥土壤中均以諾氟沙星和環丙沙星為主,而蘿卜土壤中以環丙沙星為主.另外,同種植物不同地塊土壤中喹諾酮類抗生素的含量與組成特征也有明顯差異,如4個不同地塊的大白菜土壤中喹諾酮類化合物總含量為3.97～32.03μg/kg,其中大白菜1和大白菜2土壤中以諾氟沙星和環丙沙星為主,而大白菜3和大白菜4土壤中以環丙沙星為主(圖2).不同植物對土壤中有機污染物的降解情況存在明顯差異[29],與植物根系分泌物等生理生化特征以及根際微生物種群結構與功能的差異等因素有關,這可能是導致種植不同植物土壤中喹諾酮類抗生素含量和組成差異的重要原因之一.各農戶之間不同的生產方式(如施肥、灌溉、輪作等)會造成土壤中喹諾酮類抗生素的降解性、遷移性等環境行為的不同[30],也是導致不同地塊土壤中喹諾酮類抗生素含量與組成特征差異的重要原因.

圖2 不同地塊大白菜土壤中喹諾酮類抗生素特征Fig.2 Occurrence of quinolones in different soils grown Chinese cabbage

2.3土壤剖面中喹諾酮類抗生素的含量與分布特征

喹諾酮類抗生素在土壤中具有較強的吸附性和較弱的活動性[3],因此在土壤剖面中喹諾酮類4種化合物的含量均隨著深度的增加而迅速降低,到60～80cm深度時含量降至2μg/kg以下,甚至低于定量限或檢測限(圖3).從喹諾酮類抗生素4種化合物的總含量來看,種植大白菜的土壤剖面不同深度0～20cm,20～40cm,40～60cm,60～80cm的∑QNs分別為22.04,11.85,4.83,1.94μg/kg,在表層0～20cm以下各段的降低幅度差別不大,分別為46%、59%和60%;種植苦麥菜土壤剖面不同深度0～20cm,20～40cm,40～60cm,60～80cm的∑QNs分別為31.19,4.37,3.99,0μg/kg,在表層0～20cm以下各段的降低幅度差別較大,分別為86%、9%和100%.從各化合物的組成與含量來看,大白菜土壤剖面不同深度的化合物組成特征幾乎未發生變化,均以環丙沙星為主,其次為諾氟沙星和恩諾沙星,且各化合物在表層0～20cm以下各段的降低幅度差別較小.洛美沙星由低于定量限下降到低于檢測限,恩諾沙星在60～80cm時也降低到定量限以下;苦麥菜土壤剖面不同深度化合物的組成及其含量變化情況均較復雜,在0～20cm時以環丙沙星和恩諾沙星為主,而在20～40cm和40～60cm時以環丙沙星為主,且各化合物在表層0～20cm以下各段的降低幅度差別較大.在20～40cm時諾氟沙星的含量反而略有升高,環丙沙星和恩諾沙星的降低幅度則分別高達81%和95%,到60～80cm時三者均低于檢測限,而洛美沙星在剖面各段均被檢出但都低于定量限.2個土壤剖面中喹諾酮類化合物的組成與含量變化的差異與不同植物根系生理生化特征和各農戶生產方式不同有關,如耕作方式不同影響著土壤中抗生素的活動性與遷移性[30].

圖3 土壤剖面中喹諾酮類抗生素的含量與分布特征Fig.3 Composition and level of quinolone compoundsin soil profiles

3 結論

3.1珠江三角洲地區長期施用糞肥“無公害蔬菜”生產基地土壤中4種喹諾酮類化合物的總含

量為3.97～32.03μg/kg,平均17.99μg/kg.各化合物的檢出率在92%以上,最高為17.21μg/kg,平均含量為0.17～9.31μg/kg,以環丙沙星為主,其次是諾氟沙星和恩諾沙星.

3.2化合物的含量與組成特征在平面或剖面空間分布上均存在明顯差異,隨著深度含量迅速降低,但在深度80cm仍有檢出.

3.3珠江三角洲地區長期施用糞肥蔬菜基地土壤中喹諾酮類抗生素雖然普遍檢出但含量較低,高復種指數和濕熱氣候條件有利于土壤中抗生素的降解而減輕污染程度,土壤生態毒性風險較小.

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TAI Yi-ping1, MO Ce-hui1*, LI Yan-wen1,2, WU Xiao-lian1, ZOU Xing1GAO Peng1, HUANG Xian-dong1(1.Key Laboratory of water/soil Toxic Pollutants Control and Bioremediation, Department of Education of Guangdong Province, Department of Environmental Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China；2.Institute of Hydrobiology, Jinan University, Guangzhou 510632, China). China Environmental Science, 2010,30(6)：816～821

X53

A

1000-6923(2010)06-0816-06

邰義萍(1984-),女,安徽滁州人,暨南大學環境工程系碩士研究生,主要從事土壤有機污染和農產品安全研究工作.發表論文1篇.

2009-11-13

國家自然科學基金資助項目(30671208,40773062);廣東省自然科學基金重點項目(07117909);東莞市科技計劃項目(2008108101110);惠州市科技計劃項目(09B010001009)

* 責任作者, 教授, tchmo@jnu.edu.cn