寧波地區(qū)草莓炭疽病菌株分離和生物學(xué)特性研究

姚紅燕，張 慶，張松柏

(1.浙江省寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315040;2.寧波市農(nóng)技推廣總站，浙江 寧波 315040)

草莓種植在寧波特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)中占有重要的地位，2005－2006年全市種植面積已達0.15萬hm2，產(chǎn)值達到2.5億多元。同時，通過速凍、脫水和制作草莓醬等等深加工技術(shù)，草莓產(chǎn)品正成為寧波市重要出口加工農(nóng)產(chǎn)品之一，不但進一步提升了產(chǎn)品的附加值，還為農(nóng)業(yè)增效和農(nóng)民增收作出了較大貢獻。但是，目前寧波市草莓夏秋季育苗中苗期炭疽病的發(fā)生十分普遍，對秧苗素質(zhì)和繁殖能力造成了嚴(yán)重影響，特別是正在推廣的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)新品種紅頰發(fā)病尤其嚴(yán)重，已成為品種推廣的主要制約因子。為探明寧波草莓炭疽病的病原類型和發(fā)生特點，提高病害防治技術(shù)水平，我們對寧波主要基地草莓炭疽病病株進行了病原菌分離與鑒定，并對優(yōu)勢菌株膠孢炭疽菌的生物學(xué)特性開展了研究。現(xiàn)將有關(guān)結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

草莓炭疽病病株采自寧波奉化尚田鎮(zhèn)、鄞州下應(yīng)鎮(zhèn)、鄞州邱隘鎮(zhèn)和慈溪滸山鎮(zhèn)草莓基地。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株分離

組織分離法:從田間病株樣本中選取不同發(fā)病部位的典型病斑組織，在病健交界處取樣。葉片樣品剪取5 mm×5 mm左右的小塊，匍匐莖和根莖處切成0.5 cm左右小段，根部剖開后取開始褐變的組織切成同樣長度的小段。采用0.1%升汞進行表面滅菌，處理時間2～3 min，之后用滅菌水洗3次，每次1 min，置于25℃下，于PDA培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)。

冷凍分離法:選取健康、無病斑和物理損傷的植物組織，放在塑料袋中，敞口置于－20℃冰箱內(nèi)，冷凍 1.5～2 h后取出，在含 Tween 20的0.525%的次氯酸鈉溶液中浸泡2 min表面滅菌，期間搖動數(shù)次。之后用滅菌水充分洗滌3次，每次1 min左右，待組織上的水分晾干后，置于以滅菌濾紙保濕的托盤中，用保鮮膜密封，23～25℃持續(xù)熒光光照培養(yǎng)，3～7 d可產(chǎn)生炭疽的分生孢子團，在實體顯微鏡下用滅菌的撥針挑取孢子移入改進后的炭疽選擇性培養(yǎng)基 (CIM)上，在25℃下黑暗培養(yǎng)。

1.2.2 光照對菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響

在培養(yǎng)7 d的菌落邊緣，用打孔器打取直徑為0.5 cm的菌餅，移入15 mL PDA平板上，25℃下，分別置于24 h光照、12 h、12 h光暗交替和24 h黑暗3種光照處理下培養(yǎng)，各處理重復(fù)3次，7 d后測量菌落直徑，每皿加10 mL無菌水沖洗下平板中的孢子，用血球計數(shù)板進行計數(shù)。將洗下的孢子稀釋到10×10倍鏡下30個左右·視野－1后滴到載玻片上2滴，分別置于上述光照條件下，25℃培養(yǎng)，24 h后鏡檢孢子萌發(fā)率，每處理重復(fù)3次。

1.2.3 溫度對菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響

在培養(yǎng)7 d的菌落邊緣，用打孔器打取直徑為0.5 cm的菌餅，移入15 mL PDA平板上，分別置于10，15，20，25，30，35，40℃的恒溫培養(yǎng)箱，黑暗條件下培養(yǎng)，設(shè)3次重復(fù)，7 d后測量菌落直徑，每皿加10 mL無菌水沖洗下平板中的孢子，用血球計數(shù)板進行計數(shù)。孢子萌發(fā)率計數(shù)方法同上。

1.2.4 pH值對菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響

用磷酸鹽緩沖液配制培養(yǎng)基，然后用1 mol·L－1NaOH 和 1 mol·L－1HCL 調(diào)節(jié) PDA 培養(yǎng)基的pH值為5，6，7，8，9，10，11等6個梯度，分別制成15 mL PDA平板。移入直徑0.5 cm的菌餅，于25℃下黑暗培養(yǎng)，7 d后測量菌落直徑，每皿加10 mL無菌水沖洗下平板中的孢子，用血球計數(shù)板進行計數(shù)。孢子萌發(fā)率計數(shù)方法同上。

1.2.5 病菌分生孢子致死溫度測定

每支滅菌試管中注入3 mL配制好的孢子懸浮液，每個處理3次重復(fù)，分別置于45，50，55，60℃的恒溫水浴鍋內(nèi)，處理5，10和15 min后取出，迅速放入冷水中冷卻。再置于PDA培養(yǎng)基上，于25℃、黑暗中培養(yǎng)3 d，以未處理的孢子懸浮液作對照。

2 結(jié)果和分析

2.1 菌株的分離與鑒定

采用2種方法對4地具典型發(fā)病癥狀的病株樣本進行分離后發(fā)現(xiàn)，從莖、葉部分離到的病菌有:炭疽病菌 (Colletotrichumsp.)、擬莖點霉(Dendrophoma obscurans)、鐮刀菌 (Fusariumsp.)、鏈隔孢 (Altemariasp.)和一種未知菌。從根部分離到的病菌有:炭疽病菌 (Colletotrichumsp.)、鐮刀菌 (Fusariumsp.)和一種未知菌 (表1)。

表1 各地病株樣品的病菌分離結(jié)果

對分離到的炭疽病菌進一步進行培養(yǎng)，通過分生孢子大小、性狀和菌落特性等鑒定，確定其中5個為草莓炭疽菌 (Colletotrichum fragariae)，8個為膠孢炭疽菌［Colletotrichumgloeosporioides(Penz.)］。

草莓炭疽菌的特征:菌落白色至灰白色，氣生菌絲平坦，剛毛有或無。分生孢子倒卵形，無色，單胞大小14.6～20.5(17.0)μm×5.2～6.9(6.1)μm，不易產(chǎn)生有形態(tài)，一般無子囊殼。

膠孢炭疽菌的特征:菌落灰白色至深灰色，氣生菌絲平坦，絮狀，菌落隨菌齡增長背面呈不均勻白色至灰色至黑色，剛毛有或無。分生孢子柱形，兩端鈍圓，無色，單孢大小13.8～18.7(16.3)μm×5.6～7.9(6.8)μm，有2個油球，易產(chǎn)生有形態(tài)，有子囊殼。

2.2 光照對膠孢炭疽菌菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響

3種光照處理下膠孢炭疽菌的菌絲生長量、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率比較結(jié)果顯示，在全暗光培養(yǎng)的條件下菌絲生長量、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率均達到最大值。且其中的菌絲生長量和孢子萌發(fā)率與全光照、光暗交替處理間均存在顯著性差異;產(chǎn)孢量與全光照處理間存在顯著性差異，與光暗交替處理間不存在顯著性差異 (圖1、2、3)。可見全暗光培養(yǎng)對菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)有利，尤其是對產(chǎn)孢量影響最大。

圖1 光照對膠孢炭疽菌菌絲生長的影響

圖2 光照對膠孢炭疽菌產(chǎn)孢數(shù)量的影響

2.3 溫度對膠孢炭疽菌菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響

溫度對菌絲生長、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響表現(xiàn)不太一致。菌絲生長量在25℃時表現(xiàn)最大值，且與其它處理間存在顯著性差異 (圖4);產(chǎn)孢量在30℃時表現(xiàn)最大值，其次是25℃，但兩者間不存在顯著性差異，10℃、40℃和45℃時幾乎沒有孢子產(chǎn)生 (圖5);孢子萌發(fā)率在25℃時達到最大值，其次是20℃，但兩者間不存在顯著性差異，其余處理的孢子萌發(fā)率均很低，45℃時沒有孢子萌發(fā) (圖6)。總的說來，20～30℃是最適宜菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的溫度區(qū)間;25℃最適宜菌絲生長和孢子萌發(fā)，30℃最適宜產(chǎn)孢。

圖3 光照對膠孢炭疽菌孢子萌發(fā)的影響

圖4 溫度對膠孢炭疽菌菌絲生長的影響

圖5 溫度對膠孢炭疽菌產(chǎn)孢數(shù)量的影響

圖6 溫度對膠孢炭疽菌孢子萌發(fā)的影響

2.4 pH值對膠孢炭疽菌菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響

pH值對菌絲生長、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響表現(xiàn)也不一致。菌絲在pH值5～11范圍內(nèi)均可生長，pH值為7時表現(xiàn)最大值，與其余處理間存在顯著性差異，pH值11時生長最差 (圖7);產(chǎn)孢量在pH值9與10時最大，pH值11時最小 (圖8);孢子萌發(fā)率在pH值9時最大值，與其余處理間存在顯著性差異，其次是 pH值10(圖9)。總的來說，pH值中性條件有利于菌絲生長，而產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)適宜偏堿的條件。

圖7 pH值對膠孢炭疽菌菌絲生長的影響

圖8 pH值對膠孢炭疽菌產(chǎn)孢數(shù)量的影響

圖9 pH值對膠孢炭疽菌孢子萌發(fā)的影響

2.5 膠孢炭疽菌分生孢子致死溫度測定

膠孢炭疽菌的分生孢子在45℃處理5 min和10 min后均能萌發(fā)，而在45℃處理15 min后不能萌發(fā)。所以分生孢子致死溫度為45℃處理15 min。

3 小結(jié)與討論

草莓炭疽病的病原菌有3種:草莓炭疽菌(Colletotrichumfragariae)、膠 孢 炭 疽 菌［Colletotrichum gloeosporioides(Penz.)］和尖孢炭疽菌 (Colletotrichum acutatum)。通過對來自4個草莓產(chǎn)區(qū)的80個樣品的分離、鑒定，共分離到草莓炭疽菌5個，膠孢炭疽菌8個，未發(fā)現(xiàn)尖孢炭疽菌。研究中還發(fā)現(xiàn)，即使癥狀明顯的組織，也未必能分離到炭疽病菌;在發(fā)病葉片上分離到擬莖點霉菌較多，田間易把此菌引起的葉斑病癥狀誤認為炭疽病的病斑;根部的樣品中分離到大量的鐮刀菌，所以，草莓苗期的根部病害防治也是至關(guān)重要的。

試驗發(fā)現(xiàn)，膠孢炭疽菌在10～45℃范圍內(nèi)均可生長，這與雷百戰(zhàn)對葡萄炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioide)的研究結(jié)果基本一致［1］，其菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的的適宜溫度分別為25℃、30℃和25℃;對pH的適應(yīng)范圍較廣，生長的最適pH值為7，產(chǎn)孢的最適pH值為9，孢子萌發(fā)的最適pH值是9，可見中性利于菌絲生長，偏堿性利于產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)，此結(jié)果與岑貞陸等［2－3］對大青棗及荔枝炭疽病菌的研究結(jié)果略有不同;黑暗對菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)均有利。

致死溫度測試結(jié)果顯示，膠孢炭疽菌分生孢子的致死溫度為45℃處理15 min，比張海英等［4］的研究數(shù)據(jù)略低。

［1］雷百戰(zhàn)，李國英.新疆葡萄炭疽病病原的鑒定及其生物學(xué)特性的研究 ［J］.石河子大學(xué)學(xué)報，2003，22(4):298－300.

［2］岑貞陸，謝鈴，黃思良.大青棗炭疽病的病原鑒定及其生物學(xué)特性研究 ［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)通報，2002，18(3):48－50.

［3］劉愛媛.荔枝炭疽病菌生物學(xué)特性的研究 ［J］.植物病理學(xué)報，2003(4):313－316.

［4］張海英，張明會，劉志恒.草莓炭疽病病原鑒定及其生物學(xué)特性研究 ［J］.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，38(3):317－321.