扶正活血不同組方大鼠含藥血清對HSC-T6增殖的影響＊

王者令，劉中景，宋 霆，羅瑋敏，孫曉慧

（青島市傳染病醫(yī)院，山東 青島 266033）

1 材料與方法

1.1 實驗藥品

中藥：購置于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院鑒定教研室鑒定。

中藥以“桃紅活血湯”為基本方（赤芍、丹參、桃仁、紅花），并結(jié)合2006年8月中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會肝病專業(yè)委員會《肝纖維化中西結(jié)合診療指南》臨床肝硬化常見辨證分型，以肝郁脾虛、肝腎陰虛、脾腎陽虛3種分型為“扶正”組方，組成扶正活血共3個不同方劑（簡稱1號方、2號方、3號方）。

1號方（活血化瘀健脾益氣）：桃紅活血湯加黃芪、黨參、白術(shù)、炙甘草；2號方（活血化瘀滋養(yǎng)肝腎）：桃紅活血湯加熟地、白芍、麥冬、枸杞子；3號方（活血化瘀溫補脾腎）：桃紅活血湯加附子、干姜、炙甘草、肉蓯蓉、菟絲子。

藥物制備：將扶正活血方原藥浸泡20min（水浸過藥面2cm），武火煮沸后改用文火煎30min，冷卻30min后濾渣取汁，將濾渣如上法再煎煮2次取汁。將2次藥汁混合，用文火適度，濃縮至120ml，濃度為0.75kg/L，制成扶正活血方大劑量水煎劑，置冰箱4℃?zhèn)溆谩?/p>

西藥：秋水仙堿（昆明制藥集團有限公司），購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)一附院西藥房。

秋水仙堿灌胃藥液的制備：秋水仙堿，成人（60kg）的日用量為1mg，大鼠的劑量為成人用量的30倍（即0.25mg/kg），使用時以蒸餾水調(diào)制藥液成0.025g/L。

1.2 動物及試劑

SD大鼠購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，HSC-T6細胞由廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶病研究所提供，RPMI1640培養(yǎng)基為美國GIBCO公司，注射用青霉素鈉、注射用硫酸鏈霉素為哈藥集團制藥總廠，小牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司，Trypsin 1∶250（胰蛋白酶）為美國 Difco公司，EDTA為美國GIBCO公司，PI為美國 SIGMA公司，RNase為美國SIGMA公司，MTT為美國SIGMA公司。

1.3 含藥血清動物分組及標(biāo)本采集

將SD大鼠隨機分為正常血清對照組（簡稱正常組）、秋水仙堿對照組（簡稱陽性組）、扶正活血組（1號 ～3號組）共5組，每組6只；以上各組均以相應(yīng)的藥物灌胃（正常血清對照組以生理鹽水灌胃），灌胃量均為1ml/l00g體質(zhì)量.每天灌胃2次，間隔12h，連續(xù)給藥 3d。

末次給藥后1h采血（灌藥前禁食不禁水12h），10g/L戊巴比妥鈉（0.35mL/100g）腹腔麻醉，腹主動脈采血，室溫下靜置4h，3000r/min離心15min，分離血清，同組血清相混，將各組血清用56℃水浴滅活30min，以除去可能存在的生物活性物質(zhì)，再用0.22pm微孔濾膜過濾除菌，置 －20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 HSC-T16細胞分組及各組工作液的配制

將對數(shù)分裂期的HSC-T6細胞接種入培養(yǎng)板后，以孔為單位，先按以上大鼠血清分組，每大組又按工作液中的含藥血清濃度（50、100、200ml/L的含藥血清分為3個小組，每小組設(shè)5個復(fù)孔。

低濃度小組（含50ml/L正常大鼠血清）：10μl正常大鼠血清 +190μl DMEM；中濃度小組（含100ml/L正常大鼠血清）：20μl正常大鼠血清 +180μl MEM；高濃度小組（含200ml/L大鼠血清）：40 μl正常大鼠血清+160μl DMEM。

1.5 MTT比色法檢測肝纖維化HSC-T6增殖

取對數(shù)生長期的HSC-T6細胞，在96孔板中培養(yǎng)12h，加入不同濃度的扶正活血方含藥血清，培養(yǎng)48h，MTT法測定細胞增殖抑制率。

（1）待HSC-T6細胞生長融合成單層后，用2.5g/L胰蛋白酶消化，并接種至無菌96孔板內(nèi)，細胞接種密度約為5 x 106個/L，每孔加入細胞懸液200μL，繼續(xù)培養(yǎng)；（2）在 37℃、50mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，加入無血清 DMEM培養(yǎng)液（每孔200μL）培養(yǎng)24h，使細胞同步化于靜止期；（3）棄上清，各孔按實驗分組要求加入相應(yīng)的工作液，移入細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48h；（4）48h后取出培養(yǎng)板，每孔加入 MTT溶液 20μl，37℃、繼續(xù)培養(yǎng) 4h后，小心吸去上清，每孔加入DMSO 200μl，室溫下，用微型超聲振蕩器混勻。

1.6 結(jié)果判定

用酶標(biāo)儀（波長為570nm，參比波長為450nm）測定每組細胞A值，重復(fù)3次。按以下公式計算細胞抑制率：抑制率=（1－實驗組平均A值/對照組平均A值）×100％。

1.7 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

表1、圖1顯示，各組含藥血清低濃度小組和中濃度小組，對HSC-T16細胞增殖抑制率很低，只在其高濃度時顯示有不同程度的抑制效果。與正常對照組比較，扶正活血各組方動物含藥血清對 HSCT16細胞增殖抑制率均有顯著性意義（P＜0.01），而和陽性藥物組比較則無顯著性差異。

表1 各組高濃度含藥血清對HSC-T6增殖抑制率±s）

表1 各組高濃度含藥血清對HSC-T6增殖抑制率±s）

注：與正常組比較：△△P＜0.01

組別OD值（570nm） 抑制率（％）0.98±0.19 0秋水仙堿組 0.46±0.05△△ 49 1 號 方 組 0.32±0.07△△ 67 2 號 方 組 0.44±0.05△△ 49 3 號 方 組 0.64±0.13△△正常對照組30

3 討論

HSC是用SV-60轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)15d的大鼠HSC建立起來的，它保留了所有激活HSC的特點，可以表達結(jié)蛋白、α-平滑肌肌動蛋白和膠原纖維酸性蛋白，至少傳40代仍能保持穩(wěn)定的表型［1］。對目前應(yīng)用HSC-T6進行的多項研究證明，它與原代培養(yǎng)的HSC生物性狀基本一致，其增殖能力較強，進入對數(shù)生長時間較早，且對數(shù)生長期持續(xù)時間較長，易于培養(yǎng)和維持，具有很高的穩(wěn)定性，是一個良好的進行藥理學(xué)細胞水平研究的模型［2～3］?；罨?HSC數(shù)量的增加是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)，而近年來研究證實［4］，中醫(yī)扶正活血治則均有抑制 HSC增殖的作用。本研究結(jié)果顯示，扶正活血不同組方的含藥血清對HSC的增殖有明顯抑制作用。

［1］Niteo N，F(xiàn)rideman SL，Green wel p，et al.Cyp21 mediated oxidative stressinduces collaten type 1 xwpression in rat hepatic stellate cells［J］.Hepatology，1999，30：987-996.

［2］Ankoma-sey V，Wang Y，Dai Z，Hypoxic stimulation of vascular endothelial growth factor expression in activated rat hepatic stellate ce1ls［J］.Hepatology，2000，31：141-148.

［3］Coats S，F(xiàn)lanagan WM，Nourse J，et al.Equirement of p27 Kipl for restriction point control of the fibroblast cell cycle［J］.Science，1996，272：877.

［4］蔡銳，伍參榮，胡海平，等.桃紅四物湯加丹參對肝星狀細胞增殖和凋亡影響［J］.湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005，25（6）：22-24.