批量篩檢獻血者不規則抗體的方法

李雪英 韓惠云 李志平

現代輸血技術的核心理念是安全和有效輸血。近年來，由于血液傳染性指標的檢測技術不斷進步，經輸血傳染病毒的危險性已大幅度降低。但是，由于人類血型抗原系統的復雜性，由輸血引起的輸血免疫反應時有發生［1］。保證患者輸注免疫學“相容”的血液，預防輸血不良反應，已成為廣大輸血工作者的重要研究課題。我國專家多年前就已經提出，輸血前應對受血者和供血者的紅細胞不規則抗體進行篩選［2］，以提高臨床輸血的安全性和有效性。但常規的試管法由于費時繁瑣，不可能對大量獻血者的不規則抗體進行批量篩檢。為此，筆者將96孔U型微板看作是96個“短”試管的聯合體，將間接抗人球蛋白試驗改良后在微板中進行，使獻血者不規則抗體的批量篩檢簡單易行，和試管法對比效果良好，現報告如下。

1 材料和方法

1.1 試劑 抗人球蛋白試劑(IgG)、抗-D(IgG)、篩選細胞、譜細胞由上海血液生物醫藥有限責任公司提供;抗-C、抗-c、抗-E、抗-e、抗-Fya、抗-JKa 由加拿大 Dominion Biologicals Limited公司提供;所有試劑均在有效期內使用。指示細胞由筆者在使用當天配制。

1.2 儀器設備 AT全自動樣本處理系統(瑞士HAMILTON公司);Labofuge400平板離心機(美國Beckman公司);HH.W21.600型電熱恒溫水浴箱(北京光明醫療儀器廠);HTⅢ掃描酶標儀(奧地利ANTHOS公司);KA-2200血球洗滌離心機(日本KUBOTA公司);TG-328A光學分析天平(湘儀天平儀器廠);96孔硬質U形微型板(丹麥Nunc公司)。

1.3 檢測樣品

1.3.1 19份已知不規則抗體為陽性的獻血者和受血者血清(由日常工作中用試管法篩查并已用譜細胞確定了抗體特異性)，用該法重新進行抗體篩查。

1.3.2 7 份標準抗血清:將抗-D(IgG)、抗-C、抗-c、抗-E、抗-e、抗-Fya、抗-JKa分別倍比稀釋后，和試管法平行測定其效價。

1.3.3 分批次隨機抽取本站無償獻血者標本2160份(2009年1月～2009年6月，每周三次，每次30份)，和試管法平行篩查其不規則抗體，陽性結果用譜細胞確定抗體的特異性。

1.4 醛化、包被篩選紅細胞

1.4.1 將篩選紅細胞用生理鹽水洗滌3次，再用pH7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌1次，用含3.4%葡萄糖的磷酸鹽緩沖液配制成1%的紅細胞懸液。

1.4.2 用0.05%的戊二醛處理微板，每孔加入100 μl，靜置20 min，棄去，生理鹽水洗滌1次。

1.4.3 將1%篩選紅細胞加入微孔板中，每孔50 μl，300 g離心2 min，使紅細胞平鋪孔底，靜置20 min。

1.4.4 用生理鹽水洗滌3遍，每次均輕輕拍干備用。

1.5 抗人球蛋白試劑的稀釋 用微板法對比試驗，確定抗人球蛋白試劑的最佳稀釋度為1∶3。

1.6 指示細胞的配制:將3人份O型紅細胞混合，用生理鹽水洗滌3次，取適量壓積紅細胞等量加入IgG抗-D血清，37℃孵育30 min，離心去上清，用生理鹽水洗滌5次，再用pH7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌1次，用含3.4%葡萄糖的磷酸鹽緩沖液配制成1%的紅細胞懸液備用。

1.7 檢測

1.7.1 用AT全自動樣本處理系統將檢測樣品加入醛化、包被好篩選紅細胞的微板中，每孔100 μl，同時做陽性、陰性對照各2孔，陽性對照加入與篩選細胞含有對應抗體的血清100 μl，陰性對照加入 AB 型血漿 100 μl，37℃孵育 30 min。

1.7.2 棄去孔內液體，用生理鹽水洗滌5遍，每次均輕輕拍干。

1.7.3 加入稀釋好的抗人球蛋白試劑，每孔50 μl。

1.7.4 加入稀釋好的指示細胞，每孔50 μl。

1.7.5 1200 g離心2 min，孔內紅細胞呈扣狀沉淀為陰性，平鋪于孔底為陽性。

1.7.6 用酶標儀判讀結果 根據孔內指示細胞分布情況，用酶標儀判斷結果。

2 結果

2.1 19份抗體陽性標本陽性檢出率100%，未出現假陰性。

2.2 7種抗血清效價比較，相差不超過1個滴度，見表1。

2.3 2160份獻血者標本，試管法檢出5份，陽性檢出率0.23%，微板法檢出7份，陽性檢出率0.32%，經譜細胞確認，具有臨床意義的特異性抗體均為5份，分別為1份抗-D、2份抗-E、1份抗-M、1份抗-c，說明微板法有一定的假陽性。

表1 微板法和試管法檢測7種抗血清效價比較

3 討論

隨著輸血事業的不斷發展，聚凝胺、凝膠試驗、酶法等新的不規則抗體檢測方法被廣泛應用。但確定不完全抗體的最可靠方法仍然是抗人球蛋白法［3］。在本報告中，筆者使用的微板法原理仍是抗人球蛋白試驗，改良的核心是將篩選紅細胞(抗原)固定在微板的底部，加入血清(抗體)孵育反應后，洗滌時不需要離心，包被的篩選紅細胞也脫落很少，當加入抗人球蛋白試劑和指示細胞后，結果非常容易觀察和判讀，從而克服了傳統試管法費時費力的弊端，使試驗變得方便快捷。另外筆者還利用了醛化紅細胞具有較強的吸附蛋白質抗原或抗體的能力的原理［4］，用戊二醛處理微板固定紅細胞，不但使紅細胞和板底結合的更牢固均勻，同時也提高了試驗的靈敏度，更宜于結果判讀。本法還具有以下兩方面優點，一是標本量大時，可利用全自動設備加樣和判讀結果，使檢測批量化;二是因抗人球蛋白試劑需要稀釋而降低了成本。不足之處是存在一定的假陽性，但和假陰性比較可以進一步保證輸血安全。由此可見，微板法抗人球蛋白試驗具有良好的穩定性和靈敏性，且簡單、易行、高效，完全可以替代試管法對獻血者和受血者進行不規則抗體篩檢。

［1］田兆嵩.臨床輸血學.人民衛生出版社，2002:246.

［2］王培華.輸血技術學.人民衛生出版社，1998:147-150.

［3］李勇，楊貴貞.人類紅細胞血型學實用理論與實驗技術.中國科學技術出版社，1999:158.

［4］邢培清，劉玉振.實用輸血檢驗.鄭州大學出版社，2001:195.