花生紅衣中多酚類物質清除DPPH自由基能力和抑菌性能的研究

趙 萍，林櫻姬，金征宇，王 雅，王 莉，亓文靜

（1.食品科學與技術國家重點實驗室江南大學食品科學與工程學院，江蘇無錫214122；2.蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730050）

花生紅衣中多酚類物質清除DPPH自由基能力和抑菌性能的研究

趙 萍1，2，林櫻姬2，金征宇1，王 雅2，王 莉2，亓文靜2

（1.食品科學與技術國家重點實驗室江南大學食品科學與工程學院，江蘇無錫214122；2.蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730050）

研究了花生紅衣多酚類物質對DPPH自由基的清除能力及抑菌性能。將花生紅衣多酚粗提和純化后的物質與沒食子酸標準品、單寧酸標準品及抗壞血酸的EC50值作比較，得到花生紅衣多酚粗提物EC50（0.194mg/L）＜純化花生紅衣多酚 EC50（0.705mg/L）＜沒食子酸 EC50（0.760mg/L）＜單寧酸的 EC50（5.409mg/L）＜抗壞血酸的 EC50（3.745mg/L）。純化后花生紅衣多酚對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、青霉、黑曲霉和毛霉均有抑菌性能，最低抑菌濃度為250mg/L。

花生紅衣，多酚，DPPH自由基，抑菌

Abstract：The bacteriostasis and scavenging DPPH· c apability of the polyphenols extracted from peanut testa were studied.The results showed that scavenging effects on DPPH·of cude peanut testa extract EC5（00.194mg/L）were better than purified polyphenols EC5（00.705mg/L），Gallic Acid EC5（00.76mg/L），Tannic acid EC5（05.409mg/L），∨CEC50（3.745mg/L）.There were antibacterial properties of pure polyphenols from peanut testa，such as Staphylococcus aureus，Escherichia coli，Penicillium sp.，Actinomucor sp.and Aspergillus niger.The minimum inhibiting concentrations were all 250mg/L.

Key words：peanut testa；polyphenols；DPPH·；bacteriostasic

花生紅衣中富含多酚類化合物，具有抗氧化等生物活性［1］。但在花生加工業中，花生紅衣仍作為一種經濟效益很低的副產品存在，沒有得到充分的綜合利用［2］。國內外對植物資源的研究非常活躍，從植物中提取的某些活性物質具有抗菌、抗氧化和其他生理作用，為植物源防腐劑的發展提供了物質基礎［3-4］。我國學者研究了大蒜、生姜、丁香等50多種香辛料植物及大黃、甘草、銀杏葉等200多種中草藥及其他植物如竹葉等提取物的抗菌實驗，發現有150多種具有廣譜的抑菌活性，已經作為天然防腐劑在某些食品中作了一些簡單的應用。BRANEN［5］提出酚類物質對很多細菌有效；CHANG和 BRANEN報道在真菌培養基中250mg/kg的BHA就可以抑制霉菌生長以及黃曲霉毒素的生成；RACCAH在酚類抗氧化劑抑菌活性文獻綜述中提出：酚類物質抑菌能力比較強［6］。而對于花生紅衣中多酚類物質是否也同樣具有抑菌效果的研究則比較少。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魯花大花生紅衣 山東魯花公司提供，將其粉碎過40目篩，備用；DPPH·（二苯代苦味酰基自由基）、GA（沒食子酸標準品）、單寧酸標準品 SIGMAALDRICH.Inc；無水乙醇 山東萊陽市雙雙化工有限公司；維生素C 天津市醫藥工業技術研究所；鐵氰化鉀 國藥集團化學試劑有限公司；Folin-C試劑［7］；所用試劑 均為分析純；大腸桿菌（Escherichia coli（Migula）Castellani et Chalmers，GSICC 30507）、金黃色葡萄球菌金黃色亞種（Staphylococcus aureus subsp.Aureeus Rosenbach，GSICC 31902） 由甘肅省微生物菌種保藏中心提供；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、青霉（Penicillium sp.）、黑曲霉（Aspegillus niger）、毛霉（Actinomucor sp.） 由蘭州理工大學生命科學與食品實驗中心提供。

超聲波細胞粉碎機 JY92-Ⅱ，寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-9200紫外分光光度計 UVSpectrophtotmeter Cary50 Probe；743 型 Rancimat儀瑞士萬通；電子分析天平 AB104-N梅特勒-托利多儀器有限公司；飛鴿牌臺式離心機TDL-5-A 上海安亭科學儀器廠；凍干機FD-1-55 北京博衣康實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 花生紅衣多酚的制備流程 花生紅衣粉碎篩→超聲細胞粉碎→離心→減壓濃縮→AB-8大孔樹脂純化→減壓濃縮→凍干

1.2.2 花生紅衣多酚的制備［8］花生紅衣粉碎過40目篩，以70%乙醇溶液為提取溶劑，料液比1∶12（g/mL），利用超聲細胞粉碎儀，功率為240W，超聲提取10min。提取液離心后，棄去沉淀，在30℃下減壓濃縮，蒸去乙醇，得粗提液。粗提液過AB-8大孔樹脂，60%乙醇洗脫，30℃下減壓濃縮，濃縮液至凍干機冷凍干燥，得純化后多酚產物。

1.2.3 花生紅衣多酚對DPPH·清除能力測定［9-10］DPPH·是一種人工合成的穩定自由基，其乙醇溶液顯紫色，在517nm處有最大吸收。當有自由基清除劑存在時，DPPH·的單電子由于被配對，DPPH·濃度減小而使其顏色變淺，在517nm波長處的吸光度值變小，這種顏色變淺的程度與配對電子數成化學計量關系，因而可用分光光度法進行定量分析。由于該分析方法測定簡便、快速，同時DPPH·較長的半衰期使此方法保持了良好的重現性，因此，盡管DPPH·并非人體內實際產生的自由基，對DPPH·的淬滅能力仍然可以有效地評價抗氧化劑的活性，在國內外被廣泛用于清除自由基物質性質的研究與天然抗氧化劑的篩選。其能力用清除率（Scavenging Rate，SR）來表示，清除率越大，抗氧化能力越強。

1.2.3.1 待測液的制備 將未純化的花生紅衣提取物（PTE）和經純化的花生紅衣多酚（PPTE，純度64%）、維生素 C（VC）和沒食子酸（GA）、單寧酸（TA）標準品分別配制成體積分數為0.1mg/mL的無水乙醇溶液（母液），再將所配制的母液按照要求稀釋成不同濃度的溶液。

1.2.3.2 DPPH·溶液的可見光譜 以無水乙醇為對照，精確吸取的DPPH·溶液2mL與2mL無水乙醇混合均勻后，以相對應的溶劑（4mL無水乙醇）為對照，用分光光度計測定上述溶液在最大吸收波長下的吸光度值（A0），在分光光度計上對DPPH·溶液進行在440～600nm下掃描，確定最大吸收波長為517nm。

1.2.3.3 樣品溶液對DPPH·抗氧化能力測定 精確吸取上述不同濃度的 PPTE溶液2mL，分別與0.025mg/mL的DPPH·溶液2mL和2mL無水乙醇混合，搖勻后放置30min。以相對應的溶劑（無水乙醇）為對照調零，用分光光度計分別測定上述溶液在517nm處的吸光度值（Ai和 Aj），分別測得 Ai和Aj值。

清除率 SR（%）=［1-（Ai-Aj）/A0］×100%

其中，Ai：2mL樣液與2mL的DPPH·溶液混合后在波長最大吸收波峰處的吸光度值；Aj：2mL樣液與2mL無水乙醇溶劑混合后在波長最大吸收波峰處的光值；A0：2mL DPPH·溶液與2mL無水乙醇溶劑混合后在波長最大吸收波峰處的吸光度值。

1.2.4 花生紅衣多酚抑菌性能的測定

1.2.4.1 培養基的制備 將配制好的各種菌株的培養基高壓蒸汽滅菌（121℃、15min），冷卻至 50～60℃，采用無菌操作傾注于干熱滅菌（160℃、3h）過的培養皿內，每培養皿裝15～20mL（培養皿內培養基的厚度約3～5mm），制備充足數量的菌種（每個供試菌種、每種多酚濃度做3個重復），放入4℃冰箱保存，不超過2d。

供試菌株懸浮液的制備：分別用接種針挑取少許菌體接種于裝有玻璃珠及50mL無菌生理鹽水的三角瓶中，振蕩10min，制成均勻的菌懸浮液。調整菌懸浮液的濃度，使其含孢子或菌體量在106～107個/mL之間。分別用滅菌的移液槍向凝固的平板上加0.1mL菌體懸浮液，用無菌三角玻璃刮鏟涂布均勻。

1.2.4.2 菌液的制備 用接種環挑取一環菌體或孢子放入裝有50mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，在微型漩渦混合機上充分混勻，制成菌體懸液或孢子懸液備用。

1.2.4.3 PPTE抑菌活性測定-濾紙片法 用打孔器將濾紙打成10mm的圓片，把濾紙圓片用稱量紙包好，每片稱量紙隔開放兩片在培養皿中；將培養皿包好，用干熱滅菌法滅菌（160℃、3h），分別置于不同濃度的PPTE水溶液中浸泡10min；瀝去多余試液，用無菌鑷子放在涂好菌液的培養基上。對照用0.85%的無菌生理鹽水浸泡。用無菌鑷子鑷取濾紙圓片，沿瓶壁瀝去多余的PPTE溶液，采用無菌操作置于已用菌液涂布好的培養皿中。每個供試菌種做3個平行。每個培養皿中十字形對稱放置 4 張濾紙圓片，分別用 5、3、1、0.5、0.25、0.1g/L PPTE溶液浸泡及0.85%無菌生理鹽水（對照）浸泡。細菌、平板倒置于37℃恒溫培養箱中培養24h；霉菌倒置于28℃恒溫培養箱中培養48h，取出觀察有無抑菌作用，培養結束后，用刻度尺測試培養基中抑菌圈的直徑。

1.2.4.4 最低抑菌濃度（MIC）的測定［11］參考以上方法，對幾種菌采用6種濃度的PPTE做最佳最小濃度抑菌實驗。每株菌、每個平皿用無菌打孔器有規律地均勻打6個孔，其中一個作為對照（無菌0.85%生理鹽水），其它加5種不同濃度的PPTE溶液。每種菌的每種濃度的PPTE做6個平行，觀察結果，以不長菌的最低提取物溶液濃度為該提取物的最低抑菌濃度，以其平均值作為抑菌結果。

2 結果與分析

2.1 花生紅衣多酚對DPPH·清除能力測定

通過表1可以看出，PTE、PPTE、維生素C和沒食子酸對DPPH·都有一定的清除率，且PTE的EC50＜PPTE的EC50＜沒食子酸的EC50＜抗壞血酸的EC50＜單寧酸的EC50，說明花生紅衣多酚的清除自由基的能力比抗壞血酸、單寧酸和沒食子酸強，這可能是由于花生紅衣多酚中存在一些其他抗氧化性強的物質。從表中可以看出，經大孔樹脂純化后的花生紅衣多酚的EC50值與沒食子酸標準品的EC50值相近，可以看出花生紅衣經純化后，純品的自由基清除能力已接近沒食子酸標準品。而PTE的抗氧化性強于純化后花生紅衣多酚，主要原因可能是多酚類物質比較敏感，易分解變質，由于經過一系列的純化過程，失去了其他物質的協同作用、自身的抗氧化物質產生變化，造成抗氧化活性的損失。而PTE與各單體之間可能存在相互間的作用與協同，使抗氧化能力增強。

表2 PPTE抑菌圈直徑（mm）

表3 PPTE最低抑制濃度

表1 PTE、PPTE、GA、TA 和 VC清除DPPH·回歸方程及EC50值比較

2.2 PPTE的抑菌效果

由表2可知，PPTE對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等細菌，黑曲霉、毛霉、青霉等真菌有明顯抑制作用，對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、毛霉抑制作用比較明顯，當濃度達到250mg/L以上時，既有明顯的抑菌圈產生，且抑菌能力隨濃度增加而增強，隨濃度逐步增加抑菌圈直徑相應地增大。

2.3 最低抑菌濃度（MIC）

由表3可知，PPTE對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、青霉、黑曲霉、毛霉、葡萄球菌的最低抑制濃度均為250mg/L。

3 結論

3.1 PTE對DPPH·具有較好的清除作用，半清除濃度PTE為0.194mg/L，PPTE為0.705mg/L。PPTE半清除度已接近沒食子酸標準品；而PTE的半清除度強于沒食子酸標準品。因此，花生紅衣提取物可以作為一種功能性抗氧化添加劑，在食品、醫藥、化妝品等領域具有廣闊的應用前景。

3.2 PPTE對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、青霉、黑曲霉、毛霉和葡萄球菌的生長具有一定的抑制作用，最低抑菌濃度均為250mg/L，且抑菌圈大小隨濃度的增加而增大。

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Study on capability of scavenging DPPH·and bacteriostasic activity of polyphenols from peanut testa

ZHAO Ping1，2，LIN Ying-ji2，JIN Zheng-yu1，WANG Ya2，WANG Li2，QI Wen-jing2
（1.The State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Life Science and Engineering，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050，China）

TS201.2

A

1002-0306（2010）10-0129-04

2009-10-15

趙萍（1964-），女，博士研究生，教授，主要從事農產品產后貯藏加工研究。

甘肅省自然科學研究基金計劃（0803RJZA044）。