食品中低聚異麥芽糖高效液柑色譜檢測方法研究

傅博強，王 晶，*，唐治玉，王遠興，謝明勇，付芳圓

（1.中國計量科學研究院，生物、能源與環境研究所，北京100013；2.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌321005）

食品中低聚異麥芽糖高效液柑色譜檢測方法研究

傅博強1，王 晶1，*，唐治玉1，王遠興2，謝明勇2，付芳圓1

（1.中國計量科學研究院，生物、能源與環境研究所，北京100013；2.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌321005）

針對乳制品、固體飲料、糖果、保健品等食品中添加的功能活性成分低聚異麥芽糖，包括異麥芽糖（IG2）、潘糖（P）、異麥芽三糖（IG3）、異麥芽四糖（IG4）的檢測，建立了水和乙腈為流動相，梯度洗脫，氨基色譜柱分離，蒸發光散射檢測器（evaporative light-scattering detector，ELSD）檢測食品中添加的低聚異麥芽糖含量的高效液相色譜方法。異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖、異麥芽四糖的線性工作范圍分別為 0.1～0.45mg/mL、0.1～0.45mg/mL、0.2～0.65mg/mL、0.1～0.35mg/mL，線性相關系數R2分別為1、0.9999、0.9998、0.9999。對不同類型的食品，四種低聚異麥芽糖的回收率在98.0%～105.0%之間，方法準確度高。室內重復性變異系數一般都低于10%；除了含量低的異麥芽四糖，室間再現性變異系數一般都低于10%，說明方法的重復性和再現性良好。該方法簡單、易于掌握，測定結果準確，適于復雜食品基質中低聚異麥芽糖含量的測定。

食品，低聚異麥芽糖，高效液相色譜法，含量測定

低聚異麥芽糖（Isomaltooligosacharide，簡稱IMO）是淀粉糖的一種，是葡萄糖基以α-1，6糖苷鍵結合而成單糖數為2及以上（Gn）的一類低聚糖，其主要成分為異麥芽糖（Isomaltose）、潘糖（Panose）、異麥芽 三 糖（Isomaltotriose）及 異 麥 芽 四 糖（Isomaltotetraose）等［1］。低聚異麥芽糖廣泛存在于大麥、小麥和馬鈴薯等植物中，在醬類、蜂蜜及果葡糖漿中也有少量存在。商品低聚異麥芽糖產品規格主要有兩種：IMO-50型（IG2+P+IG3+Gn≥50%）和IMO-90型（IG2+P+IG3+Gn≥90%）。IMO-50型含有一定量葡萄糖、麥芽糖；而IMO-90型含葡萄糖和麥芽糖較少，產品純度較高［1］。低聚異麥芽糖屬于非消化性低聚糖類，難以被胃酶消化，具有水溶性膳食纖維功能，其熱量低，基本上不增加血糖血脂，有助于維持腸道正常細菌群平衡，改善腹瀉與便泌，提高機體免疫力［2］。鑒于低聚異麥芽糖的特性和保健功能，其已被日益廣泛應用于保健品、食品、醫藥、化妝品等領域［3］。為了實現對食品中添加的低聚異麥芽糖含量的準確定量，需要建立適用性強的檢測方法。不同聚合度IMO結構和性質相似，GB/T 22224 -2008中采用的凝膠柱無法實現有效的分離分析。我國《低聚異麥芽糖》產品標準GB/T 20881-2007中，對低聚異麥芽糖糖漿和糖粉中的各種低聚異麥芽糖的含量采用TSKgel Amide-80氨基鍵合柱，乙腈∶水（67∶33）作為流動相、流速1.0mL/min、柱溫75℃，外標法進行定量［1］。對食品中添加的低聚異麥芽糖測定，李黎等［4］采用氨基色譜柱、乙腈∶水（67∶33）作為流動相、流速1.0mL/min、柱溫40℃分離測定沖劑和干吃鮮奶片等食品中的低聚異麥芽糖，平均回收率為97.27%，樣品測定值相對標準偏差為1.53%～7.89%（n=5）。陳桂茹等［5］使用300mm×4.6mm的Hypersil氨基柱，乙腈∶水（78∶22）為流動相，內部溫度為40℃的示差檢測器，測定飲料中低聚異麥芽糖的含量，異麥芽糖和異麥芽三糖的回收率范圍分別為88.5%～101.0%、90.1%～102.0%，相對標準偏差 ＜5%。食品基體成分復雜，只能采用等度洗脫的示差折光檢測器已不能滿足不同基體食品中低聚異麥芽糖含量的測定，本研究以酸性乳飲料、口服液和果凍作為研究對象，建立了水和乙腈為流動相梯度洗脫，氨基色譜柱分離，蒸發光散射檢測器分析檢測食品中添加的低聚異麥芽糖含量的高效液相色譜法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石油醚（30～60℃） 分析純；異麥芽糖標準品（純度≥98%）、潘糖標準品（純度≥98%） Sigma公司，分析純；異麥芽三糖標準品（純度≥98%）、異麥芽四糖標準品（純度≥95%） 美國US Biological公司，分析純；乙腈 Fisher公司，色譜純；酸性乳飲料、口服液、果凍樣品 市售，購自北京市某超市。

100、1000μL移液器 美國ephendof公司；50mL Teflon具螺紋蓋離心管 美國 nunc公司；孔徑0.45μm的有機相微孔濾膜、1.0mL一次性無菌注射器、空氣發生器 國產；Agilent 1200高效液相色譜系統 配有四元高壓輸液泵、自動進樣器、柱溫箱、ChemStation色譜工作站和35900E數模轉換器，美國安捷倫公司；Alltech ELSD 2000ES蒸發光散射檢測器 美國 Grace公司；ME235S sartorious電子天平（感量0.0mg）、CP324S Ssartorious電子天平（感量0.1mg） 北京賽多利斯天平有限公司；pc 420D磁力加熱攪拌器 北京康林科技有限責任公司；DZF-6050真空干燥箱 上海博訊事業責任有限公司；DK-8D電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；IKA MS2旋渦混合器 德國；CQ25-12D超聲波清洗機 上海新芝儀器責任有限公司；3k30臺式高速冷凍離心機 德國SIGMA公司；旋轉蒸發儀 日本EYELA公司；MiLLi-Q超純水制備系統 美國MILLIPORE公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制

1.2.1.1 低聚異麥芽糖混合標準儲備液的配制 準確稱取異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖、異麥芽四糖標準品各約5mg（精確至0.01mg）至10mL容量瓶中，加水定容至刻度，混合均勻，稱重（精確至0.1mg），得到標準儲備液，4℃冰箱中可穩定保存1個月。濃度用質量濃度表示（mg/g）。

1.2.1.2 低聚異麥芽糖混合標準工作溶液的配制

用移液器分別準確移取低聚異麥芽糖混合標準儲備液250、500、1000μL，稱重（精確至0.1mg），分別補加水750、500、0μL，得到濃度分別為0.125、0.25、0.5mg/mL的系列混合標準工作溶液，4℃冰箱中可穩定保存1個月。

1.2.2 樣品的預處理

1.2.2.1 樣品的干燥處理 對奶粉、豆粉等固體粉末狀樣品，如果計算占干物質的含量，需要依據GB/T 5009.3-2003《食品中水分的測定》測定水分含量。

1.2.2.2 樣品的脫脂處理 對脂肪含量大于20g/100g的樣品如奶粉、豆粉，需進行脫脂處理。方法如下：稱取1.5g干燥后的樣品，精確至0.1mg。放在50mL離心管中，加40mL石油醚，磁力攪拌器攪拌30min，冰箱中冷卻10min。3000r/min（離心力1620×g）離心5min，棄掉上清液，重復以上步驟2次。將離心管蓋子打開，在通風櫥中蒸發殘存的石油醚，然后放入60℃真空干燥箱干燥2h，研磨成粉末。稱量脫脂干燥后的樣品，精確至0.1mg，計算脂肪含量。

1.2.3 樣品的提取

1.2.3.1 固態樣品 稱取經干燥、脫脂處理的奶粉或豆粉1.2g左右（精確稱量至0.1mg），放在50mL離心管中。加 10mL 80℃熱水，在 80℃水浴中提取10min，在0、5、10min時用渦旋儀分別渦旋10s。取出后，冷卻至室溫。加10mL乙腈，劇烈振蕩5min，靜置30min，8000r/min（離心力6010×g）離心5min，取上清液轉移至25mL容量瓶中，加水定容至刻度。取1.5mL用0.45μm的有機相微孔濾膜過濾，所得濾液供HPLC分析。

1.2.3.2 液態乳制品樣品 準確吸取12.5mL酸性乳飲料，放在50mL離心管中。與同體積的乙腈混合，充分振搖5min后靜置30min，8000r/min（離心力6010×g）離心5min，轉移上清液至25mL容量瓶中。在離心的沉淀中再加入3mL 80℃熱水和2mL乙腈，充分振搖后靜置，8000r/min離心5min，將兩次的上清液合并。提取液用0.45μm的有機相微孔濾膜過濾，所得濾液供HPLC分析。

1.2.3.3 口服液 準確吸取一定體積的口服液，用50%的乙腈定容至25mL容量瓶中。從此溶液中取一定體積的溶液，用50%乙腈稀釋至合適的濃度（使低聚異麥芽糖的濃度在標準工作曲線的線性范圍內，即0.1～0.65mg/mL）。用0.45μm的有機相微孔濾膜過濾，所得濾液供HPLC分析。

1.2.3.4 糖果類（果凍） 稱量1.0g果凍，精確稱量至0.1mg，置于50mL離心管中。加10mL 80℃熱水，在80℃水浴中提取10min，在0、5、10min時用渦旋儀分別渦旋10s。取出后，冷卻至室溫。加11mL乙腈，劇烈振蕩5min，靜置30min，6010×g離心5min，取上清液轉移至25mL容量瓶中，加水定容至刻度。取1.5mL用0.45μm的有機相微孔濾膜過濾，所得濾液供HPLC分析。

1.2.4 色譜分析條件

1.2.4.1 高效液相色譜分離條件 色譜柱：Alltech PrevailTMCarbohydrate ES氨基色譜柱（4.6mm × 250mm，5μm），保護柱（4.6mm×20mm，5μm，美國Grace公司）；柱溫：30℃；流動相：A：乙腈，B：水。

梯度洗脫程序見表1、表2。

表1 只含低聚異麥芽糖食品樣品的梯度洗脫程序

表2 同時含低聚異麥芽糖和低聚果糖的食品樣品的典型梯度洗脫程序

對不同的食品基體，洗脫條件進行相應的調整。

流速：1.0mL/min；進樣量：10μL。

1.2.4.2 蒸發光散射檢測器分析條件 對 Alltech ELSD 2000ES蒸發光散射檢測器，設定漂移管溫度87℃，載氣流速2.3mL/min。

1.2.5 測定方法 在1.2.4.1色譜條件下測定系列低聚異麥芽糖混合標準工作溶液中異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖、異麥芽四糖的響應值（峰面積），以濃度為橫坐標，低聚異麥芽糖的峰面積為縱坐標，分別繪制4種低聚異麥芽糖的標準曲線，用二次方程對曲線進行擬合，得到校準工作曲線二次線性回歸方程。

取10μL樣品溶液注入高效液相色譜儀，測定試樣的響應值（峰面積）。由4種低聚異麥芽糖的校準工作曲線線性回歸方程，采用外標法計算樣品溶液中低聚異麥芽糖的濃度。

1.2.6 結果計算 樣品中異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖、異麥芽四糖的含量按下式計算：

式中：X-異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖、異麥芽四糖的含量，單位為mg/100g樣品；ci-由校準工作曲線線性回歸方程計算得到的異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖、異麥芽四糖的質量濃度，單位為mg/mL；V-樣品定容的體積，單位為mL；DF-稀釋因子，即待測的樣品溶液被稀釋的倍數；m-脫脂后樣品的稱樣量，單位為g；F-樣品的脂肪含量，單位為%。

平行測定結果用算術平均值表示，保留兩位有效數字。

2 結果與討論

2.1 標準曲線及線性范圍

不同于紫外和示差折光檢測器，ELSD檢測器的響應值（Y）與被測物濃度（X）的關系曲線比較復雜，在低濃度范圍內，響應值與被測物濃度為二次函數關系，即Y=aX2+bX+c，在較高濃度范圍內，才大致呈線性［6］。食品中添加的低聚異麥芽糖的量都不高，因此，本研究的校準工作曲線采用二次方程進行擬合，結果表明，異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖、異麥芽四糖的線性工作范圍分別為0.1～0.45mg/mL、0.1～0.45mg/mL、0.2～0.65mg/mL、0.1～0.35mg/mL，線性相關系數R2分別為1、0.9999、0.9998、0.9999，濃度與峰面積的線性關系良好，見圖1。

圖1 異麥芽糖（IG2）、潘糖（P）、異麥芽三糖（IG3）、異麥芽四糖（IG4）的標準工作曲線

2.2 不同類型食品中低聚異麥芽糖高效液相色譜分析譜圖

對不同類型的食品，其中各種營養成分的組成和含量各不相同，因此需要對流動相的比例和洗脫程序進行調整，以保證四種低聚異麥芽糖與食品基體中干擾成分，尤其是碳水化合物類的其它低聚糖實現有效的分離。酸性乳飲料、口服液和果凍中低聚異麥芽糖的分析譜圖見圖2～圖4。果凍樣品中同時含有低聚異麥芽糖和低聚果糖，它們的性質相近，因此會干擾彼此的分離。通過優化乙腈的起始濃度和洗脫梯度的變化速度，可以將低聚異麥芽糖與低聚果糖（蔗果三糖GF2、蔗果四糖GF3、蔗果五糖GF4）有效分離，見圖4。

圖2 酸性乳飲料中低聚異麥芽糖高效液相色譜分析譜圖

2.3 方法的檢出限

Study on determination of isomaltooligosaccharides in foods by high performance liquid chromatography method

FU Bo-qiang1，WANG Jing1，*，TANG Zhi-yu1，WANG Yuan-xing2，XIE Ming-yong2，FU Fang-yuan1
（1.National Institute of Metrology，Beijing 100013，China；2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 321005，China）

For the determination of isomaltooligosaccharides in foods such as dairy products，solid drinking，candy and healthy food，a high performance liquid chromatography method was established.lsomaltose（lG2），panose（P），isomaltotriose（lG3）and isomaltotetraose（lG4）in various foods were separated on a NH2column by gradient elution and detected by evaporative light-scattering detector（ELSD）.The linear ranges of the calibration curves for lG2，P，lG3and lG4were 0.1～0.45mg/mL，0.1～0.45mg/mL，0.2～0.65mg/mL and 0.1～0.35mg/mL，respectively. The linear correlation coefficients（R2）were 1，0.9999，0.9998 and 0.9999，respectively.As to different kinds of foods，the spike recoveries were in the range of 98.0%～105.0%.Coefficient variability of repeatability and reproducibility were less than 10%，respectively，except the reproducibility of isomaltotetraose.The method was simple and was apt to be grasped，can be used in the quantification of isomaltooligosaccharides in complex food matrix.

food；isomaltooligosaccharides；high performance liquid chromatography；content determination

TS247

A

1002-0306（2010）10-0388-05

2010-08-18 *通訊聯系人

傅博強（1975-），男，博士，副研究員，研究方向：食品及生物計量。

國家標準化管理委員會國標委（20071141-T-469）。