枯草芽孢桿菌彈性蛋白酶的純化及酶學性質研究＊

劉書亮,吳琦,詹莉,賴文

1(四川農業大學食品學院,四川雅安,625014) 2(四川農業大學生命與理學院,四川雅安,625014)

枯草芽孢桿菌彈性蛋白酶的純化及酶學性質研究＊

劉書亮1,吳琦2,詹莉2,賴文1

1(四川農業大學食品學院,四川雅安,625014) 2(四川農業大學生命與理學院,四川雅安,625014)

對枯草芽孢桿菌BE M01菌株發酵液中的彈性蛋白酶進行了分離純化,并研究了酶學性質。先后采用了硫酸銨分級沉淀、離子交換層析和分子篩層析等方法,彈性蛋白酶的回收率為7.88%,純化倍數為13.79,結合SDS-PAGE和分子篩層析確定該彈性蛋白酶是一單鏈蛋白,分子量約為31 ku。對酶學性質的研究表明,該彈性蛋白酶屬于含有Ca2+的金屬蛋白酶類;其最適作用溫度為50℃,具有良好的熱穩定性;在硼砂-硼酸緩沖體系、Tris-HCl緩沖體系中酶最適反應pH分別為7.4和8.6,在pH 8.0～11.0酶活力趨于穩定;10 mmol/L的Ca2+有激活和穩定酶活作用,SDS和吐溫-80也有激活酶活作用,而Li+、Na+、Zn+、K+、Ba2+、Mg2+、Mn2+和EDTA對酶活均有不同程度的抑制作用;其催化動力學方程為:y=0.186x+32.493;Vmax=0.0308 U/mL,Km=0.0057 g/mL。

彈性蛋白酶,枯草芽孢桿菌,純化,酶學性質

彈性蛋白酶(EC3.4.4.7,Elastase)是一種以水解不溶性彈性蛋白(elastin)為特征的蛋白水解酶[1],主要用作治療高血脂癥和防止動脈粥樣硬化癥。同時,其廣譜蛋白水解活性和對彈性蛋白的優先特異降解性顯示其作為肉類嫩化劑具有廣闊的應用前景和較高的商業價值[1-2]。彈性蛋白酶可從動物胰臟中提取或由微生物發酵制得[3]。我國該產品的生產主要由胰臟提取,但受胰臟資源的限制,胰彈性蛋白酶供不應求。利用微生物生產彈性蛋白酶可為醫藥和食品工業提供充足的酶源。近年關于微生物產彈性蛋白酶的研究已有不少報道,主要集中在菌種選育、培養條件優化以及酶的純化及其特性等方面。研究顯示,不同微生物源的彈性蛋白酶在性質上存在一定的差異,分子量從21-39.5 ku不等,其最適pH跨越7.4-11.7等[4-13]。枯草芽胞桿菌屬于公認安全(generally regarded as safe,GRAS)的微生物。本實驗室從屠宰場周圍土壤中分離篩選并經紫外線誘變選育出1株高產彈性蛋白酶的枯草芽孢桿菌(B acillus subtilis)BEM01[14-15],10L罐發酵酶活可達200 U/mL以上。本研究旨在對菌株BEM01發酵液進行分離純化,對其酶學性質進行研究,為該酶的大規模制備和實際應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株

枯草芽孢桿菌(B acillus subtilis)BEM01,由四川農業大學食品學院食品微生物實驗室保存。

1.1.2 主要試劑

彈性蛋白(Elastin);地衣紅-彈性蛋白(Elastinorcein);牛血清白蛋白(BSA),購自Sigma公司;胰彈性蛋白酶(酶活120 U/mg),購自上海林瑞生物科技有限公司;考馬斯亮藍G-250,購自Fluka;透析袋(分子截留量為14 ku)(Spectropor);DEAE-Cellose(Amresco);SephadexG-100(Phamacia);SDS-PAGE試劑盒,碧云天生物技術有限公司;其他試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養基

(1)種子培養基(%):葡萄糖1.0,蛋白胨0.5,酵母膏0.5,KH2PO40.2,MgSO4.7H2O 0.01,pH 7.5,121℃滅菌20 min。

(2)發酵培養基(%):干酪素2.0,葡萄糖2.0,蛋白胨0.2,酵母膏0.2,吐溫-800.01,KH2PO40.2,MgSO4·7H2O 0.01,CaCl20.01,pH值7.5,121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 發酵上清液制備

挑斜面培養物1環接種于2 mL種子培養基中于37℃培養24 h后,取300μL菌液接種于10 mL發酵培養基中培養24 h,然后按3%的接種量接種于250 mL發酵培養基中于37℃培養24 h,即為種子液,再在RZ-10L發酵罐中發酵:裝料系數0.65,接種量3%,發酵溫度37℃,起始pH值7.5,轉速控制在300 r/min,必要時加無菌菜籽油消泡,發酵至32h放罐,得發酵液,再于4℃,8000 r/min離心30 min去菌體,得發酵上清液(粗酶液)。

1.2.2 彈性蛋白酶酶活力的測定方法

參照我國現行藥用彈性蛋白酶測定方法和Sachar[16]進行測定。稱取10 mg地衣紅-彈性蛋白,加入 p H 8.8的 0 .2 mol/L的硼酸緩沖液 2mL,再加入1 mL適當稀釋的酶液,于55℃水浴振蕩反應 1h,加入 p H 6.0,0.2 mol/L磷酸緩沖液2 mL終止反應,10000 r/min離心10 min后,將上清液于590 nm測定吸光度。以不加酶液的反應系統為空白對照。在此條件下,水解1 mg地衣紅-彈性蛋白所需酶量定義為1個彈性蛋白酶活單位(U)。

1.2.3 彈性蛋白酶的純化

收集發酵上清液1 L,經30%和70%飽和度硫酸銨分級沉淀。離心收集沉淀,溶解于緩沖液A(0.2 mol/L硼酸緩沖液/1 mmol/L CaCl2/pH7.4),并用相同緩沖液4℃透析。經BaCl2檢測不含硫酸銨后,酶液12000 r/min離心10 min后,取上清液過0.22μm微孔濾膜,將濾液轉入透析袋,用聚乙二醇-20000,4℃濃縮至8 mL。取濃縮樣品適當稀釋后上DEAECellose柱(Amresco),用緩沖液A與0.5 mol/L NaCl做線性梯度洗脫,流速1 mL/min,收集濃縮活性峰。取樣品上Sephadex G-100柱(Phar macia),用流速為0.75 mL/min的緩沖液A洗脫,收集濃縮活性峰,備用。采用SDS-PAGE測定純化后酶蛋白質的分子量[17]。

1.2.4 彈性蛋白酶酶學性質研究

1.2.4.1 溫度和pH對酶的影響

將酶液分別在30℃、37℃、45℃、50℃、55℃、60℃和70℃下保溫1 h,按標準方法測定酶活力,測定酶的最適反應溫度。將酶液于不同溫度下處理不同時間后,在最適反應溫度測定剩余酶活力,分析該酶的熱穩定性[18-19]。

將酶液分別在0.2 mol/L硼砂-硼酸緩沖液(pH7.4～9.0)和0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.1～8.9)中反應1 h,測定酶的最適反應pH。將酶液分別于pH 4.0～5.0(0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉),pH 6.0～7.0(0.2 mol/L磷酸緩沖液),pH 7.4～9.0(0.2 mol/L硼酸-硼酸鈉),pH 9.5～10.6(0.05 mol/L硼砂-氫氧化鈉),于20℃放置24 h,取出立即放置冰浴,用0.2 mol/L硼砂-硼酸緩沖液調pH到7.4,測定剩余酶活力,分析該酶的pH穩定性[18-19]。

1.2.4.2 金屬離子和EDTA對酶活力的影響

在酶反應體系中加入Li+、K+、Na+、Mg2+、Ba2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+等金屬離子和EDTA至終濃度為10 mmol/L,測定不同金屬離子和EDTA對酶活的影響[18-19],以不加金屬離子或EDTA處理的酶活為空白對照(CK)。

1.2.4.3 SDS、吐溫-80、乙醇和丙酮對酶活力的影響

在酶反應體系中,加入SDS和吐溫-80至終濃度為0.01%、0.1%、0.5%和1%,或加入乙醇和丙酮至終濃度為2%、5%、10%和20%,按標準方法測定酶的相對活力,分析各試劑對酶活性的影響[18-19]。

1.2.5 酶反應動力學常數的測定

在酶反應體系中,分別加入3 mg、6 mg、10 mg、12 mg、15 mg、18 mg、24 mg和30 mg的底物,測定其酶促反應速度[18-19]。以底物濃度的倒數(1/S)為橫坐標,以酶的反應初速度的倒數(1/V)為縱坐標,作Lineweaver-Bruk雙倒數圖,求出膠原蛋白酶的Vmax和Km。

2 結果與分析

2.1 彈性蛋白酶的分離純化

枯草芽孢桿菌BEM01培養上清液經硫酸銨分級沉淀后,溶解透析后樣品過DEAE-Cellose柱,共有3個洗脫峰,其中第1個洗脫峰具有彈性蛋白酶活性。將活性峰洗脫液收集濃縮后過Sephadex G-100柱,共有2個洗脫峰,其中第1個洗脫峰具有彈性蛋白酶活性。將活性峰洗脫液收集濃縮,備用。彈性蛋白酶的分離純化結果見表1。結果表明,通過3步純化,最后的彈性蛋白酶樣品的純化倍數為13.79和回收率為7.88%。SDS-PAGE表明,獲得了電泳純的彈性蛋白酶,分子量約為31 ku(見圖1)。

表1 枯草芽孢桿菌BEM01彈性蛋白酶的分離純化

圖1 彈性蛋白酶純化產物的SDS-PAGE

2.2 溫度對酶活性及其穩定性的影響

在pH7.8條件下,測定各反應溫度下的酶活,結果見圖2。可以看出,該酶的最適反應溫度為50℃,當溫度高于60℃時,酶活力迅速損失超過50%,在37～50℃,酶活力可維持在65%以上。熱穩定結果表明(圖3),酶在37℃以下保溫4 h內,酶活穩定,損失不超過20%;在50℃保溫超過2 h,酶活損失30%左右;在60℃保溫超過1 h,酶活開始快速下降,但隨著時間的延長,相對酶活仍穩定在60%左右。

圖2 反應溫度對彈性蛋白酶酶活性的影響

圖3 彈性蛋白酶的熱穩定性

2.3 pH對酶活性及其穩定性的影響

在50℃條件下,測定各反應pH條件的酶活,結果見圖4。結果表明:在pH值7.5～9.0,該酶的最適反應pH值與緩沖體系有關。在硼砂-硼酸緩沖體系中,酶的最適反應pH值為7.4;而在Tris-HCl緩沖體系中,最適pH為8.6。彈性蛋白酶pH值穩定性結果見圖5。結果表明:彈性蛋白酶在pH值7.4～11.0相對穩定,能保持在最高酶活的80%以上。當pH<7.0時,酶活力大幅度的下降,從74%迅速下降到30%。

圖4 反應pH值對酶活性的影響

圖5 酶的pH值穩定性

2.4 金屬離子和EDTA對酶活力的影響

考察不同金屬離子和EDTA對酶活力的影響,結果見表2。結果表明,在10 mmol/L濃度下,Ca2+對該彈性蛋白酶具有顯著的激活作用,相對酶活提高為對照的123.1%。Li+,K+,Na+、Mg2+、Ba2+、Mn2+和Zn2+等絕大多數金屬離子對酶活具有一定的抑制作用。而10 mmol/L的EDTA,對該彈性蛋白酶具有強烈的抑制作用,酶活損失超過80%。可見,該彈性蛋白酶為含有Ca2+的金屬蛋白酶類。

表2 金屬離子對酶活力的影響

2.5 SDS、吐溫-80、乙醇和丙酮對酶活力的影響

表面活性劑SDS和吐溫-80,以及有機溶劑乙醇和丙酮對彈性蛋白酶活性的影響結果見圖6和圖7。結果表明,SDS和吐溫-80對酶活有明顯的激活作用,隨著濃度的增加,酶活迅速上升;在1%濃度下,酶活分別為對照的316%和267%。低濃度的乙醇和丙酮對酶活沒有明顯影響,當超過5%后,酶活逐漸下降;當濃度達到20%時,仍具有70%的相對酶活,表明該酶在分離純化時經乙醇或丙酮沉淀后,殘留的微量試劑對酶活的影響有限。

圖6 表面活性劑對酶活的影響

圖7 有機溶劑對酶活的影響

2.6 彈性蛋白酶酶促動力學常數的測定

采用Lineweaver-Burk做圖法將米氏方程化為倒數形式:

式中:V代表反應速度,Vmax代表最大反應速度;[S]代表底物濃度;Km代表米氏常數。通過作圖法求得直線方程為y=0.186x+32.493。從方程解得,Vmax=0.0308 U/mL,Km=0.0057g/mL。

3 討論

本研究采用經紫外誘變后和發酵優化后的高產菌株枯草芽孢桿菌BEM01,使得對彈性蛋白酶的分離純化更具有可操作性。在純化過程中,先后采用了硫酸銨分級沉淀、離子交換層析和分子篩層析等方法,獲得了7.88%的回收率和13.79的純化倍數。分析數據表明,該純化過程中從硫酸銨分級沉淀到離子交換層析階段,酶活損失較大,可能是由于透析硫酸銨過程和PEG20000濃縮的時間較長所致。結合SDS-PAGE和分子篩層析結果,確定該彈性蛋白酶是一單鏈蛋白,分子量約為31 ku。以上結果,與陳啟和[12]、王娟麗[20]、劉宇峰[13]、Tsai[4]和Kaur[7]等報道的芽孢桿菌彈性蛋白酶分子量分別為29.5 ku、27 ku、27.8 ku、25 ku和25 ku比較接近,但其氨基酸組成是否存在差異,有待進一步研究。

酶的穩定性直接決定了其實用性。本研究表明,枯草芽孢桿菌BEM01彈性蛋白酶的最適溫度為50℃,與目前報道的大多數該酶的最適溫度一致,僅比肖昌松等[5]報道的芽孢桿菌彈性蛋白酶最適作用溫度(55℃)略低。該酶在60℃下保持4 h后仍有60%活性,而陳啟和等[12]報道的地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶在60℃下保溫60 min后酶活幾乎全部消失,劉宇峰等[13]報道彈性蛋白酶在50～60℃下保溫20 min酶全部失活,這表明該酶具有良好的熱穩定性。已報道的芽孢桿菌蛋白酶大多數屬于中性蛋白酶,其最適反應pH均在7.0以上。本研究中的枯草芽孢桿菌BEM01彈性蛋白酶在不同緩沖對中的最適反應pH分別為7.4和8.6,且其堿穩定性好,而其酸穩定性差。這與陳啟和[12]、劉宇峰[13]報道的芽孢桿菌彈性蛋白酶的最適反應pH為7.4一致,與肖昌松[5]、Kaur[7]報道的芽孢桿菌彈性蛋白酶的最適pH為9.0較接近,而與Tsai[4]報道的芽孢桿菌彈性蛋白酶的最適pH為11.75不同。因此,必須嚴格控制使用該酶時的環境pH。

大多數細菌產生的彈性蛋白酶屬于金屬離子蛋白酶家族。本實驗中10 mmol/L Ca2+使酶活提高127%,表明Ca2+對彈性蛋白酶的激活有明顯的促進和穩定作用,EDTA則嚴重抑制該酶的活性,表明該彈性蛋白酶屬于含有Ca2+的金屬蛋白酶類。而Li+、Na+、Zn+、K+、Ba2+、Mg2+和Mn2+對酶活均有不同程度的抑制作用。以上結果與大多數文獻報道一致[4,11-13]。龔德欽等[21]認為,溶液中存在適當濃度的Ca2+對于維持彈性蛋白酶空間結構、保持酶的活性及防止自溶有作用。KazuyukiMorihara[22]在研究假單胞菌產彈性蛋白酶時發現,Ca2+的存在還與彈性蛋白酶的產生有關。因此,在微生物發酵、彈性蛋白酶純化及保存、酶反應中應添加微量Ca2+非常必要。此外,SDS和吐溫-80等表面活性劑對本彈性蛋白酶具有很強的激活作用,在實際應用中,應充分利用這一性質,使酶催化反應達到事半功倍的效果。

枯草芽孢桿菌BEM01彈性蛋白酶屬于含有Ca2+的金屬蛋白酶類,具有良好的熱穩定性,最適作用pH為中性或微堿性條件,適宜在肉類嫩化中應用。因此,枯草芽孢桿菌BEM01產生的彈性蛋白酶具有良好的開發應用前景。本課題組已克隆了該彈性蛋白酶基因,以及其高效表達載體的構建,正在進行基因工程菌酶的純化及其性質研究。

[1]顏子穎,關國雄.微生物發酵生產藥用彈性蛋白酶[J].中國醫藥工業雜志,1991,22(10):469-472.

[2]唐寶英,朱曉慧.微生物彈性蛋白酶研究概況[J].工業微生物,1998,28(1):40-44.

[3]劉小杰,陳啟和,孫橋.彈性蛋白酶的研究進展[J].中國食品添加劑,2004(4):29-32.

[4]Ying-Chieh Tsai.Purification and fulther charactelization of an alkaline elastase produced by alkalophilic.Bacillus strainYa-B[J].Applied and Envirnmental Microbiology,1988,54(12):3156-3161.

[5]肖昌松,呂健,田新玉,等.嗜堿芽孢桿菌XE22-4-1堿性彈性蛋白酶發酵條件的研究[J].微生物學報,2001,41(5):611-616.

[6]賀稚非,陳宗道,李洪軍,等.胞外彈性蛋白酶的理化特性及其影響因素[J].食品與發酵工業,2005,31(4):10-13.

[7]Mohinder Kaur,Tripathi K K.Production and partial characterization of elastase of Bacillus subtilisisolated from the cervices of human females uterus[J].Microbiol,1988,34:855-859.

[8]顏子穎,關國雄,張維欽,等.胞外彈性蛋白酶產生菌的篩選及酶的純化[J].微生物學報,1995,35(1):50-57.

[9]FrocoM,Chase T,Macmillan J D.Purification and properties of the elastase fromAgergillus fum igatus[J].Infection andImmunity,1992,60(3):728-734.

[10]曹軍,陳源,李桂芳,等.微生物生產彈性蛋白酶的研究[J].微生物學雜志,1996,16(3):9-13.

[11]Deborah J Clark,Steven J Harrylik,Edward Kavanagh,et al.Purification and characterization of a unique alkaline Elastase from Micrococcus luteus[J].Protein Expression and Purification,2000,18:46-55.

[12]Chen Qi-he.Studies on cultivation kinetics for elastase production byBacillussp.EL31410[J].Joural of Agriculture And Food Chemistry,2004,52(11):3356-3359.

[13]劉宇峰,陳麗娟,王金英,等.枯草桿菌彈性蛋白酶的理化性質研究[J].生物技術,2003,13(2):28.

[14]張娟,劉書亮,吳琦,等.產彈性蛋白酶芽孢桿菌的篩選與鑒定[J].四川農業大學學報,2007,25(3):253-256,261.

[15]吳琦,劉書亮,張娟.產彈性蛋白酶枯草芽孢桿菌發酵條件研究[J].食品與發酵工業,2008,34(11):91-94.

[16]SaeharL,Winter K,SicherN,et al.Photometric method for timation of elastase activity[J].Proc Soe Exp Bid Med,1955,90:323-326.

[17]Hames B D.Gel Eectrophoresis of Proteins:A Practical Approach(2nd ed.) [M].Oxford:Oxford University Press,1990.

[18]陳啟和,何國慶,鄔應龍.彈性蛋白酶產生菌的篩選及其發酵條件的初步研究[J].浙江大學學報:農業與生命科學版,2003,29(1):59-64.

[19]顏子穎,關國雄.微生物彈性蛋白酶的研究進展[J].微生物學通報,1991,18(6):356-359.

[20]王娟麗,王以強,李奠礎.彈性蛋白酶生產菌種的篩選及發酵條件的研究[J].生物技術,2005,15(5):24-26.

[21]龔德欽,何杰.六種因子對豬胰彈性蛋白酶激活水平的影響[J].中國生化藥物雜志,1992(3):36-40.

[22]KazuyukiMorihara.Production of elastase and proteinase byPseudomonas aeruginosa[J].American Society forMicrobiology,1964,88(3):745-757.

ABSTRACTThe purification of elastase was achieved by combination methods of ammonium sulfate precipitation,ionexchange chromatography and gel filtration chromatography.The elastase was purified 13.79-fold to apparent homogeneity with 7.88%overall recovery.It was a single-chain protein with a molecular mass of 31ku,and est imated by S DS-PAGE and gel filtration.Studies on enzymatic properties showed as follows:the elastase belonged to metalloproteinase containing Ca2+.The elastase activity had a temperature opt imum of 50℃alongwith good ther mal stability.Meanwhile itwasopt imal at pH 7.4 in borax-boric acid buffer or pH 8.6 in Tris-HCl,and tended stability be tween 8.0 and 11.0.10mmol/L Ca2+had stabilizing and activation on the elastase activity,whereas S DS and T ween-80 only had activation.Moreover,the elastase activitywas inhibited varying degrees bymany irons(Li+,Na+,Zn+,K+,Ba2+,Mg2+,Mn2+)and EDT A.The catalyzes dynamics equation was:y=0.186x+32.493,Vmax=0.0308 U/mL,Km=0.0057g/mL.

Key wordselastase,B acillus subtilis,purification,enzymatic properties

Purification and Characterization of Elastase fromBacillus subtilis

Liu Shu-liang1,Wu Qi2,Zhan Li1,LaiWen1
1(College of Food,Sichuan Agriculture University,Ya’an 625014,China)
2(College of Life Science,Sichuan Agriculture University,Ya’an 625014,China)

碩士,副教授。

＊四川省教育廳重點項目(07ZA054)

2010-01-13,改回日期:2010-03-11