南藥五味子提取物的抗菌及抗氧化作用＊

馬永全,于新,黃雪蓮,楊敏

(仲愷農業工程學院輕工食品學院,廣東廣州,510225)

南藥五味子提取物的抗菌及抗氧化作用＊

馬永全,于新,黃雪蓮,楊敏

(仲愷農業工程學院輕工食品學院,廣東廣州,510225)

應用瓊脂平板擴散法、DPPH·法、結晶紫法、鄰苯三酚自氧化法,測定五味子提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門氏菌的抑菌活性及清除 1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH·)、羥自由基(·OH)、超氧陰離子(·)的能力。結果表明,五味子提取物對大腸桿菌、金黃色葡球菌、乙型副傷寒沙門氏菌 3種食品常見致病菌均具有強的抑菌作用,抑菌圈直徑均在 20 mm以上。其中,五味子乙醇提取物對大腸桿菌、金黃色葡球菌、沙門氏菌的抑菌圈和MIC及對 DPPH·、·OH、·清除活性 EC50分別為 34.8 mm,28.6 mm,23.2 mm,0.1250 g/mL,0.0313g/mL,0.1250 g/mL,0.69 mg/mL,0.78 mg/mL,0.57 mg/mL;蒸餾水提取物的抑菌圈和MIC清除率分別為 25.4 mm,23.0 mm,23.4 mm,0.1250 g/mL,0.0625g/mL,0.1250 g/mL,0.72 mg/mL,0.63 mg/mL,0.61 mg/mL。說明五味子提取物具有明顯的抗菌和抗氧化作用。

南藥五味子,提取物,抗菌作用,抗氧化作用

南藥五味子(Kadsura longipedunculata),又稱華中五味子,屬五味子科(Schisandraceae)五味子屬(Schisandra)植物,是我國衛生部 2002年公布的可用于保健食品的中草藥之一。具有益氣 、斂肺、生津、止渴、止瀉、斂汗、壯陽、補腎等功能,是產自我國的名貴中藥材[1-2]。五味子及其部分親緣種普遍含有木脂素,且不同品種的含量和成分有較大差異,一般含有揮發油、有機酸及脂肪油,此外還含有五味子甲素、乙素、乙醇及甲、乙、丙、丁、戊酯等成分[3]。動物和臨床實踐證實,五味子對病毒性肝炎或化學中毒性肝損傷有降低轉氨酶和改善癥狀的作用,對中樞神經系統有興奮作用,能改善條件反射的形成,提高大腦皮層細胞的機能[4]。據報道,五味子提取物對大鼠腦、肝、腎微粒體的脂質過氧化有顯著的抑制能力,可維持斷奶仔豬血液正常生化指標[5-6]。但有關五味子提取物抑菌活性的報道甚少。本試驗采用 2種不同溶劑的提取物,研究了五味子提取物的抗菌和抗氧化作用,旨在為開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

1.1.1 材料與儀器

五味子果實,購于廣東陽西縣。

電子天平(Sartorial公司);MJ-176NR型多功能粉碎機(松下電器產業株式會社);DHG-9140A型電熱恒溫干燥箱(廣東環凱微生物科技有限公司);PHS-25型酸度計(上海偉業儀器廠);UV-1700型紫外可見分光光度計(島津分析儀器廠);HH數顯恒溫水浴鍋(金壇市金城國勝試驗儀器廠);TGL-16C型臺式離心機(上海安寧科學儀器廠);R201D-II型旋轉蒸發儀(無錫星海王生化設備有限公司)。

1.1.2 菌種

大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),仲愷農業工程學院微生物實驗室;乙型副傷寒沙門氏菌(Salm onella paratyphiB,CMCC50094),廣東省微生物菌種保藏中心。

1.1.3 試劑

1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH·)、鄰苯三酚,為美國 Sigma公司產品。結晶紫、FeSO4、30%H2O2、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、HCl、KH2PO4、K2HPO4、無水乙醇等均為國產分析純試劑。

1.2 試驗方法

1.2.1 五味子 70%乙醇和水提取物的制備

五味子經 60℃干燥后粉碎,過 60目篩,取五味子粉 10 g,用 70%乙醇和蒸餾水進行 80℃水浴,料液比為 1∶10,浸提6h。將浸出液根據不同需要濃縮至不同體積,定容,4℃貯存備用(抗菌試驗前需經121℃,30 min滅菌 )。

1.2.2 菌液的制備

將各試驗菌種活化后,用生理鹽水配成菌懸液,經比濁法判定菌量,稀釋到 109CFU/mL。

1.2.3 抑菌圈的測定

待培養基冷卻到 55℃左右,接入含菌量為 109CFU/mL的指示菌的菌懸液,接種量為 10%。滅菌后將 3個牛津杯放在培養皿上。每種菌倒 5個平板,3個作為平行組,2個作為對照組。培養基完全凝固后,取出牛津杯。用移液槍往平行組培養皿的各小孔內加入 0.06 mL的五味子提取物,對照組培養皿小孔內加入 0.06 mL無菌水作為對照。把各平板放置于37℃恒溫培養箱中培養 24 h后,測量抑菌圈直徑。

1.2.4 最低抑菌濃度(MIC)的測定

分別取滅菌試管 8支,將提取物濃縮液1mL以滅菌生理鹽水倍比稀釋(1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280),另用無菌水加入 9 mL瓊脂培養基做無提取液的對照,倒 10 mL瓊脂培養基作為無菌水的對照。每種菌倒 7個平板,3個作為提取液的平行組,2個作為無提取液的對照組,2個作為無菌水的對照組。待完全凝固后加 0.1 mL菌懸液涂布于平板上(無菌水對照組則加 0.1 mL無菌涂布),在 37℃下培養 24 h,觀察菌落生長情況,以不長菌的五味子提取物最低濃度為 3種食品常見致病菌的最低抑菌濃度(MIC)。

1.2.5 提取物對 DPPH·清除率的測定

參照Vattem等[7]的方法。用蒸餾水和 70%乙醇分別配制濃度為 0.2 mg/mL,0.4 mg/mL,0.6 mg/mL,0.8 mg/mL,1.0 mg/mL和 1.2 mg/mL提取物溶液,精確吸取不同濃度的提取物溶液 2.0 mL放入試管中,加入 2.0×10-4mol/L DPPH·溶液(無水乙醇配制)2.0 mL,搖勻后于室溫下放置 30 min,測定其在 517 nm處的吸光度值(AS);以水或 70%乙醇代替樣品為空白對照(A0);以 2.0 mL不同濃度的提取物溶液與 2.0 mL水或 70%乙醇混合液為樣品對照(AX),以消除樣品本身顏色的影響;以水或 70%乙醇校正儀器 0點,重復測定 3次。清除率 R計算:

1.2.6 提取物對羥自由基(·OH)的清除率的測定

采用結晶紫分光光度法[8],用蒸餾水和 70%乙醇分別配制濃度為 0.2 mg/mL,0.4 mg/mL,0.6 mg/mL,0.8 mg/mL,1.0 mg/mL和 1.2 mg/mL的提取物溶液。具體試驗步驟為在一系列 50 mL具塞比色管中分別加入 0.4 mmol/L結晶紫溶液 1.5 mL,1.0mmol/L FeSO4溶液 2.0 mL,2.0 mmol/L H2O2溶液 1.0 mL。調至 pH 4.0,稀釋到 50 mL并搖勻,放置30 min后,測 580 nm處的吸光度 A,同時測定不加H2O2時 580 nm處的吸光度 A0。則羥自由基的產生量可以用ΔA=A-A0表示。樣品液對羥自由基清除率的測定:在上述反應體系中加 H2O2之前,加入2mL蒸餾水或 70%乙醇抽提的不同濃度的五味子提取物溶液,測定其吸光度 AS,樣品組對·OH的清除率(R)計算:

1.2.7 提取物對超氧陰離子(·)清除率的測定

采用鄰苯三酚自氧化法[9-10]。用蒸餾水和 70%乙醇分別配制濃度為 0.2 mg/mL,0.4 mg/mL,0.6 mg/mL,0.8 mg/mL,1.0 mg/mL和 1.2 mg/mL的提取物溶液。具體操作為:每支試管加入 3.0 mL Tris-HCl緩沖液(pH8.2),0.2 mL五味子提取液,(37±0.5)℃水浴平衡 10 min后,加入 7 mmol/L的鄰苯三酚溶液 0.3 mL,準確反應 4.0 min,加入 12 mol/LHCl0.8 mL終止反應,在 320nm處測吸光度,計算清除率(R):

式中:A0,空白液的吸光度,以蒸餾水或 70%乙醇代替樣品液的吸光度;As,樣品組的吸光度;A1,五味子提取物本身的吸光度,以蒸餾水或 70%乙醇代替反應試劑的吸光度。

2 結果分析

2.1 抑菌圈測定結果

五味子乙醇、水提取物對大腸桿菌、金黃色葡球菌、乙型副傷寒沙門氏菌 3種食品常見致病菌均具有強抑菌作用,抑菌圈直徑均在 20 mm以上,醇提物的抑菌效果強于水提物的抑菌作用。其中醇、水提物對大腸桿菌的抑菌圈分別為 34.8 mm、25.4 mm,對乙型副傷寒沙門氏菌的抑菌圈達 23.2 mm、23.4 mm,對金黃色葡球菌的抑菌圈達 28.6 mm、23.0 mm。

2.2 最低抑菌濃度(MIC)測定結果

五味子乙醇、水提取物對大腸桿菌、金黃色葡球菌、乙型副傷寒沙門氏菌 3種食品常見致病菌的MIC均很低,當濃度稀釋到 0.1250 g/mL時,仍能對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門氏菌達到100%的抑菌效果。濃度為 0.0625g/mL時,醇提取對金黃色葡萄球菌仍可抑制,水提取對大腸桿菌也可抑制,對其它菌則無抑制作用。最終結果表明,水提物對大腸桿菌的 MIC為 0.0625g/mL,金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門氏菌的MIC為0.1250 g/mL;醇提物對金黃色葡球菌的MIC可低至 0.0313g/mL,對大腸桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌的 MIC為0.1250 g/mL。

2.3 五味子提取物對DPPH·的清除效果

五味子水和乙醇的提取物對 DPPH·具有較好的清除作用,結果如圖 1所示。

圖1表明,五味子提取物對 DPPH·具有較高的清除率,且清除率隨提取物濃度的增加而增強。當其濃度為 1.2 mg/mL時,水提取物和醇提取物的清除率分別為 88.16%和 93.83%。在試驗濃度范圍內,乙醇提取物對 DPPH·的清除率均高于水提取物。說明對DPPH·的清除物質在水和醇溶液下均存在。以體系中DPPH·的吸光值減少 50%時抗氧化劑的濃度為準,即半數抑制濃度(EC50)。南五味子水、醇提取物清除 DPPH·的 EC50分別是 0.72 mg/mL和0.69 mg/mL。

2.4 五味子提取物對·OH的清除效果

五味子水和乙醇的提取物對·OH的均有抑制作用,水提物的清除作用強于醇提物。結果見圖2。

圖2 五味子提取物對·OH的清除作用

由圖2可知,在 0.2～0.6 mg/mL,水提物的清除率從 23.66%增加到 44.68%,增幅達 19%。在整個試驗濃度范圍內,水提取物對·OH的清除率均高于醇提取物。水提取物和醇提取物的清除率均隨提取物濃度的增加而增強。但醇提物清除率隨濃度增幅變化不大,可能因為清除·OH自由基的抗氧化物質水溶性的較多,而醇溶性的較少。當濃度為 1.2 mg/mL時,水和乙醇提取物的清除率分別為63.17%、32.26%。以體系中·OH的吸光值減少50%時抗氧化劑的濃度為準,即半數抑制濃度(EC50)。南五味子水、醇提取物清除·OH的 EC50分別是 0.63 mg/mL、0.78 mg/mL。

2.5 五味子提取物對·的清除效果

圖3 五味子提取物對·的清除作用

3 結論

五味子提取物對大腸桿菌、金黃色葡球菌、乙型副傷寒沙門氏菌 3種食品常見致病菌均具有強的抑菌作用,抑菌圈直徑均在 20 mm以上。五味子乙醇提取物對大腸桿菌、金黃色葡球菌、沙門氏菌的抑菌圈和MIC分別為 34.8 mm,28.6 mm,23.2 mm,0.1250 g/mL,0.0313 g/mL,0.1250 g/mL,對 DPPH·、·OH、·清除活性分別為 93.83%,32.26%,18.22%;蒸餾水提取物對大腸桿菌、金黃色葡球菌、沙門氏菌的抑菌圈和 MIC分別為 25.4 mm,23.0 mm,3.4 mm,0.1250 g/mL,0.0625g/mL,0.1250 g/mL,對 DPPH ·、·OH、·清除率分別為86.16%,63.17%,3.37%。

4 討論

(1)南藥五味子提取物對 G+(金黃色葡萄球菌)、G-(大腸桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌)細菌均有較強的抑制作用,并且在提取物較低濃度時具有較強的抑菌作用。可見,南藥五味子在食品防腐和水果保鮮等領域具有廣闊的應用前景。

(3)五味子提取物對 DPPH·有較高的清除能力,醇提物明顯強于水提取。而對·OH的清除作用,水提物卻強于醇提取。說明清除自由基的抗氧化物質既溶于水也溶于醇,但對具體的自由基,其抗氧化物質卻有略有不同。初步推斷,對不同自由基具有清除作用的活性物質可能為不同成分,或是多種成分綜合作用的結果,具體抗氧化成分可能是五味子酮、五味子乙素、五味子二醇等。一般認為,抗氧化劑的作用機理主要包括 3個方面:1是對自由基的直接清除作用。2是阻斷自由基的反應鏈;3是提高體內抗氧化酶活力和抗氧化物質含量,如谷胱甘肽等[10]。有研究表明,五味子酚對自由基有直接的清除作用[10]。但五味子中其它抗氧化物質抗氧化作用的機理仍在研究中。

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ABSTRACTTo study the effectsofAntibacterial and anti-oxidation of Extracts fromKadsura longipedunculata.The inhibition effect of the extracts fromK.longipedunculataagainstE.coli,S.aureus,S.paratyphiand its scavenging abilities to 1,1-2-phenyl-2-bitter phenylhydrazine radical(DPPH·),hydroxyl radical(·OH),superoxide anion(·)were respectively deter mined via agar plate diffusion method,DPPH·method and pyrogallol auto-oxidation method.The extracts fromK.longipedunculata,with its inhibition zone diameters larger than 20mm,have strong inhibition effect to three kinds of food pathogenic bacteria:E.coli,S.aureusandS.paratyphi.Inhibition zone diameters of inhibition andMI C of ethanol extract againstE.coli,S.aureus,S.paratyphiwere 34.8mm,28.6mm,23.2mm,0.1250g/mL,0.0313 g/mL,0.1250 g/mL respectively,and scavenging abilities to 1,1-2-phenyl-2-bitter phenylhydrazine radical(DPPH·),hydroxyl radical(·OH),superoxide anion(·)were 0.69mg/mL,0.78mg/mL,0.57mg/mL.Distilledwater extract ofK.longipedunculataandMI C againstE.coli,S.aureus,S.paratyphiwere 25.4mm,23.0mm,23.4mm,0.1250 g/mL,0.0625g/mL,0.1250 g/mL respectively and scavenging abilitiesof 1,1-2-phenyl-2-bitterphenylhydrazine radical(DPPH ·),hydroxyl radical(·OH),superoxide anion(·)were 0.72mg/mL,0.63mg/mL,0.61mg/mL.K.longipedunculataextract has strong anti-oxidation and inhibition effect to bacteria.

Key wordsKadsura longipedunculata,extract,antibacterial,antioxidation

Study on Ant im icrobial and Anti-oxidation Activities of Extracts fromKadsura longipedunculata

Ma Yong-quan,Yu Xin,Huang Xue-lian,YangMin
(College of Light Industry and Food Science,ZhongkaiUniversity ofAgriculture and Engineering,Guangzhou 510225,China)

碩士研究生(于新教授為通訊作者)。

＊廣東省科技計劃項目(2005B20401002)

2010-01-27,改回日期:2010-04-02