透明質酸的變溫發酵研究＊

吳華昌,徐靜,鄧靜,張偉娜

(四川理工學院生物工程學院,四川自貢,643000)

透明質酸的變溫發酵研究＊

吳華昌,徐靜,鄧靜,張偉娜

(四川理工學院生物工程學院,四川自貢,643000)

采用獸疫鏈球菌進行搖瓶發酵,研究了30～40℃范圍內溫度對透明質酸(HA)分批發酵的影響,結果表明:34℃時菌體量最大為13.1 g/L,38℃下HA的產量最高為82 mg/100 mL;在此基礎上,提出分階段控制溫度策略,通過L18(37)正交實驗優化出的最優變溫發酵條件是:發酵前期控制溫度在34℃,進入穩定期12 h時,改變發酵溫度至40℃,在此變溫條件下發酵HA的產量可達105.3 mg/100 mL,比38℃恒溫發酵提高了28.4%。

透明質酸,變溫發酵,獸疫鏈球菌

透明質酸(hyaluronic acid,簡稱HA),作為一種國際上公認的生物大分子保濕劑,在醫藥,化妝品,保健食品等領域有著廣泛應用[1-3],其需求量也在不斷增加。HA的生產主要有組織提取法和細菌發酵法,發酵法由于原料易得,成本低,有較高的分子量和產量,而逐漸成為生產HA的主要方向,并開展了許多研究工作[4]。

溫度對發酵過程的影響是多方面的,主要是影響各種酶反應的速率,影響微生物代謝調控機制,改變菌體代謝產物的合成方向以及影響發酵液的理化性質,進而影響發酵的動力學特性及產物的生物合成[5]。一般而言,最適發酵溫度是既適合菌體生長,又適合代謝產物合成的溫度,但最適生長溫度與最適產物合成溫度往往是不一致的[6-7]。本文在前人研究的基礎上,首先考察了不同溫度對HA分批發酵的影響,確定出最適菌體生長溫度和產物形成溫度;在此基礎上又提出了變溫發酵,即在生長階段選擇最適生長溫度,以利于菌體迅速生長繁殖,在產物生成階段選擇最適生產溫度,以利于產物形成,從而達到高生產強度,高產率和高產量的相對統一。

1 材料與方法

1.1 菌種

獸疫鏈球菌(Streptococcus zooepidem icus)原始菌株,四川理工學院生物工程學院保藏菌種。

1.2 培養基

斜面培養基:葡萄糖1 g,蛋白胨0.5 g,KH2PO40.1 g,MgSO4·7H2O 0.05 g,瓊脂1.5 g,水100 mL,pH 7.0,121℃滅菌30 min。

種子培養基:葡萄糖2 g,酵母膏2.5 g,KH2PO40.1 g,MgSO4·7H2O 0.3 g,MnSO4·4 H2O 0.01 g,水100 mL pH 7.0,121℃滅菌30 min。

發酵培養基(%):葡萄糖2,蛋白胨1,酵母膏0.5,KH2PO40.2,MgSO4·7H2O 0.05,pH 7.5,121℃滅菌30 min。

1.3 培養條件

斜面培養:將保藏菌種接入試管斜面培養基中劃線培養,37.5℃培養15 h。

種子培養:用5 mL無菌水洗試管斜面,菌液接入搖瓶種,裝液量為40 mL/250 mL,在200 r/min,37℃條件下培養12 h。

恒溫發酵:裝液量為75 mL/500 mL的搖瓶中,接種量1 mL,用搖床在200 r/min,不同溫度(30、32、34、36、38、40℃)下培養20 h,其中每隔2h取樣測值。

變溫發酵:裝液量為75 mL/500 mL,接種量1 mL,200 r/min下培養20 h,發酵過程中用2個搖床實現溫度的變化。

1.4 分析方法

葡萄糖的測定:DNS法[8],菌體的測定:干重法[9],HA的測定:Bitter-Muir法[10]

2 結果與分析

2.1 溫度對HA分批發酵的影響

在不同溫度下進行恒溫發酵,每隔2 h取樣測定發酵液中葡萄糖濃度,菌體干重和HA的含量,結果如圖1～圖3。

圖1 不同溫度下葡萄糖的消耗曲線

圖2 不同溫度下細胞生長曲線

圖3 不同溫度下HA的生物合成過程曲線

由圖1知,30℃下,殘糖的濃度較高,其他發酵溫度下隨著溫度的升高,葡萄糖進入快速消耗期的時間提前,而且殘糖很少,葡萄糖基本被利用,葡萄糖濃度由最初的2.5%降至0.3%左右。

由圖2知,30～40℃,菌體生長曲線良好,有明顯的延滯期,對數生長期和穩定期,隨著溫度的提高,菌體生長的延滯期縮短,進入對數生長期和穩定期的時間提前。30～34℃,16 h時進入穩定期,36～40℃內12 h進入穩定期,提前了4 h左右。由穩定期內各溫度的菌體干重知34℃是菌體的最適生長溫度,菌體量可達13 g/L。

由圖3知,HA的合成曲線與菌體生長曲線偶聯,在30～36℃內,隨著溫度的提高,HA的產量在增加。38℃下發酵進入穩定期之前HA的產量不高,但進入穩定期之后,HA的產量明顯提高。38℃時HA的產量最高為82 mg/100 mL,可能是因為在較高溫度下,菌體莢膜上的HA更容易脫落,所以產量有所提高。此時HA對葡萄糖的產量系數轉化率為34.36 mg/g,生產強度為3.90 mg/(100 mL·h)。

2.2 HA變溫發酵條件的確定

以HA產量為指標,采用正交試驗對發酵過程中變溫前的溫度(A),變溫時間(B),變溫后的溫度(C)3個因素的3個水平進行考察。

表1 正交試驗因素和水平設計表

變溫前的溫度,變溫時間和變溫后的溫度這3個因素又相互有影響,就要考慮它們之間的交互作用,試驗中就以HA的產量為指標,用L18(37)正交試驗設計進行實驗,結果見表2。

表2 正交試驗結果與分析表

續表2

由因素的影響主次可知,變溫時間對變溫發酵的影響最大,根據指標越大越好,可以得到優方案為A3B2C2,即變溫前的溫度為34℃,變溫時間是12 h,變溫后的溫度為40℃,即表2中的8號實驗,在該條件下HA的含量達105.30 mg/100 mL,比38℃恒溫發酵產量提高了28.4%,此時HA的產率系數為46.39 mg/g,其生產強度為5.27 mg/(100 mL·h)。

以HA為主要指標,用SPSS軟件對表2的結果進行方差分析,估計各因素對試驗結果影響的重要程度,結果如表3所示。

表3 方差分析表

由方差分析表不僅可以看出各因素的影響主次,根據F值還可以判斷出各因素影響的顯著性,變溫時間對試驗的影響非常顯著,變溫前后的溫度對結果的影響顯著,交互作用的影響較小。

在最佳變溫條件優方案A3B2C2下進行HA變溫發酵,變溫發酵過程中葡萄糖的消耗,菌體的生長和HA的產生情況如圖4。

圖4 分段控制溫度條件下發酵過程曲線

由圖4中HA的生成曲線可以看出,在發酵進入穩定期(12 h)后,改變發酵溫度HA的產量有了明顯的提高,因為發酵前期溫度控制在菌體的最適生長溫度34℃上,前期菌體生長狀態良好,12 h后改變發酵溫度至40℃,不僅可以促進莢膜多糖的脫落,而且HA的溶解度增大,也利于HA的產生。

將圖1到圖4的試驗數據進行整理,得到不同溫度下HA分批發酵過程參數,如表4所示。

由表4知,在整個發酵過程中,溫度對不同參數的影響是不同的,甚至是相反的。在恒溫發酵過程中,細胞平均比生長速率在34℃時達到最大為0.181/h,同時細胞生產強度和產率系數也是最大,HA平均比合成速率在38℃時達到最大為6.2 mg/(g·h),此時的HA生產強度和產率系數也最大。變溫發酵與恒溫發酵相比,HA的產量,生產強度和產率系數都比38℃恒溫發酵提高了25%左右,由此可見在HA發酵過程中采用變溫發酵能更好的實現產量,生產強度和產率系數的統一。

表4 不同溫度下HA分批發酵過程參數比較

3 結論

在Streptococcus zooepidem icus分批發酵生產HA過程中,相對較低的溫度34℃下可以促進細胞生長,菌體濃度可達13.1 g/L,此時菌體對葡萄糖的產量系數為0.58 g/g,而較高溫度38℃下HA的產量更高,為82.00 mg/100 mL,生產強度為4.10 mg/(100 mL·h),HA對葡萄糖的產量系數為34.36 mg/g,主要是因為在較高溫度下,更多的莢膜多糖脫落,產量提高。通過溫度對HA發酵的影響可知,在整個發酵過程中控制單一的溫度很難實現促進細胞生長和增加HA合成的統一。

在以生長為主的階段,選擇最適生長溫度,以利于菌體迅速生長繁殖,而在產物合成階段,選擇較高溫度促進莢膜脫落,產物生成,由此提出了分階段控制發酵溫度的策略。通過正交試驗確定出最優的變溫發酵條件是:控制發酵前期溫度為34℃,發酵至12 h時,改變發酵溫度到40℃,此時HA的產量為105.30 mg/100 mL,比38℃恒溫發酵提高了28.4%,此時HA的產率系數為46.4 mg/g,其生產強度為5.3 mg/(100 mL·h),由此可見變溫發酵過程中生產強度,產率和產量有有所提高,本文提出的分階段控制溫度進行變溫發酵是有效的。

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ABSTRACTHA batch fermentation process usingStreptococcus zooepidem icuswas discussed under different temperatureswhich were varied from 30℃to 40℃,the results show that the optimal bacterial growth temperature is 34℃and the highest yield up to 82mg/100mL at 38℃.Application of a two-stage temperature control strategy was developed base on those studies.The orthogonal ofL18(37)indicated thatwhen pre-fermentation temperature was controlled at 34℃and changed to 40℃in product synthesis phase,the yield of HA increased to 105.30 mg/100 mL,which is 28.4%higher compared to that of fermentation at single temperature of 38℃.

Key wordshyaluronic acid,variable-temperature fer mentation,Streptococcus zooepidem icus

Application of a Two-Stage Temperature Control Strategy for HA Batch Fermentation Process

Wu Hua-chang,Xu Jing,Deng Jing,ZhangWei-na
(Bio-Engineering,Sichuan University of Science and Engineering,Zigong 643000,China)

碩士,副教授。

＊四川省應用基礎研究項目(No.2006J13-169)

2009-11-16