耐鹽酵母固定化方法的初步研究＊

楊秋明,郭彩華,蔡慧農,王璋

1(集美大學生物工程學院,福建廈門,361021) 2(中國食品發酵工業研究院,北京,100027)

耐鹽酵母固定化方法的初步研究＊

楊秋明1,郭彩華1,蔡慧農1,王璋2

1(集美大學生物工程學院,福建廈門,361021) 2(中國食品發酵工業研究院,北京,100027)

以不同的固定化材料對耐鹽酵母進行固定化,從中選擇適宜的固定化載體。采用正交實驗確定了適宜固定化的條件,并采用SPSS統計軟件進行極差和方差分析。結果表明,海藻酸鈉-氯化鈣固定化耐鹽酵母優于瓊脂、明膠固定化耐鹽酵母,當海藻酸鈉濃度4 g/100 mL,CaCl2濃度為1.4 mol/L,發酵溫度為28℃時,耐鹽酵母的固定化效果較好。

耐鹽酵母,固定化,載體,真正發酵力

固定化技術是現代生物工程領域的重要內容之一,它是指利用化學或物理手段將游離的細胞(微生物)或酶,定位于限定的空間區域并使其保持活力并可反復使用的一種基本技術[1]。

由于固定化酵母克服了傳統游離酵母發酵工藝中酵母與產品分離困難、易流失、影響產品質量等問題,且具有生長快、反應迅速、抗污染能力強、可連續使用、產物分離方便等優點,然而到目前為止,尚無一種可用于所有種類的微生物細胞固定化的通用方法,因此,對某一特定的微生物細胞來說,必須選擇其合適的固定化方法和條件[1]。

日本于1982年開始研究把固定化細胞發酵用于醬油釀造,以低鹽發酵液為底物,用海藻酸鈉、聚乙稀醇或陶瓷制品為載體,分別固定耐鹽酵母菌和乳酸菌,以提高醬醪中成味物質的含量,國內也有類似的研究[2]。本論文主要利用包埋法和共價結合法,研究三種載體固定化耐鹽酵母的固定化效果,從中選擇一種適宜的固定化載體,通過這種固定化載體研究分析載體濃度、固定化溫度對固定化耐鹽酵母發酵性能的影響,分析固定化酵母與游離酵母發酵性能的區別,優化出耐鹽酵母細胞的固定化條件,為酵母細胞的固定化提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌株

耐鹽酵母拉頂菌名JM01(廈門淘化大同調味品公司提供的后熟醬醪中分離得到的酵母)。

1.1.2 培養基

麥氏培養基(McCLary)(g/L):葡萄糖10.0,KCl 1.8,酵母膏2.5,醋酸鈉8.2,NaCl 100.0,瓊脂粉15.0,pH自然。

YPD液體培養基(g/L):葡萄糖20.0,酵母粉10.0,蛋白胨20.0,食鹽160.0 pH自然。

高糖YPD培養基:在原有YPD培養基的基礎上添加5%葡萄糖,5%的蔗糖。

以上培養基滅菌條件均為121℃,20 min。

1.1.3 試劑

酵母粉購買于OXOLD公司,蛋白胨、葡萄糖購買于國藥集團化學試劑有限公司,牛肉膏購買于廣東環凱微生物科技有限公司;純化瓊脂粉購買于上海中科昆蟲生物技術開發有限公司(分裝);海藻酸鈉購買于青島洋峰海藻有限公司;食鹽、蔗糖食品級;其它試劑均為國產分析純試劑。

1.1.4 儀器

S W-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司),YXQ-LS-30SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實業有限公司醫療設備廠),恒溫培養搖床(上海智城分析儀器制造有限公司),生化培養箱(寧波萊福科技有限公司),DBMB5-223JP2-5型數碼顯微鏡(Motic顯微鏡),721型分光光度計(上海第三分析儀器廠)。一次性注射器:醫用級,市售。

1.2 實驗方法

1.2.1 耐鹽酵母種子培養液的制備

挑取新鮮斜面菌種1環,接入裝有30 mL YPD培養基的300 mL錐形瓶中,28℃振蕩培養至對數期。取濕菌體細胞,用生理鹽水配成10 g/100 mL菌懸液(以濕菌體計)。

1.2.2 耐鹽酵母細胞的包埋固定化

(1)瓊脂凝膠固定化細胞的制備:4.0 g/100 mL瓊脂溶液滅菌后冷卻至45℃,以4∶1的比例加入菌懸液,混合均勻,倒入無菌平皿中待凝,待充分凝固后將其切成大小為3×3×3 mm3的塊狀,用無菌水洗滌。按10%(v/v)接種量將固定化耐鹽酵母細胞置于200 mL YPD培養基中,在28℃下發酵 5d。在發酵結束時測定固定化顆粒的強度、耗糖量及透光率。同時,以相同接種量的游離細胞的發酵情況作為對照相比較。

(2)海藻酸鈉凝膠固定化細胞的制備:4.0 g/100 mL海藻酸鈉溶液滅菌后冷卻至45℃,以4∶1的比例加入菌懸液,混合均勻,倒入一次性注射器外套,通過直徑為2.5-3.0 mm的小孔,以恒定的速度滴到盛有10%CaCl2溶液(已滅菌)的平皿中制成凝膠珠。浸泡30 min后,將凝膠珠轉入300 mL錐形瓶中,用無菌去離子水洗滌。按10%(v/v)接種量將固定化耐鹽酵母細胞置于200 mL YPD培養基中,在28℃下發酵5 d。在發酵結束時測定固定化顆粒的強度、耗糖量及透光率。同時,以相同接種量的游離細胞的發酵情況作為對照相比較。

(3)吸取10 mL 10%菌懸液加入25 mL濃度為2 g/100 mL的明膠液中,混合均勻,倒入無菌平皿中,在0-5℃凍結后,切成3×3×3 mm3小塊,再浸入1.5%戊二醛中,室溫下交聯3 h,將顆粒轉入300 mL錐形瓶中,用無菌去離子水洗滌3次,按10%(v/v)接種量將固定化耐鹽酵母細胞置于200 mL YPD培養基中,在28℃下發酵5 d。在發酵結束時測定固定化顆粒的強度、耗糖量及透光率。同時,以相同接種量的游離細胞的發酵情況作為對照相比較。

1.2.3 耐鹽酵母固定化條件的選擇

以氯化鈣濃度、海藻酸鈉濃度和發酵溫度為試驗因素,采用L9(34)正交實驗設計,各因素的水平見表1。

表1 L9(34)正交實驗設計因素水平表

用無菌水洗滌凝膠珠后,按10%(v/v)接種量將固定化耐鹽酵母細胞置于200 mL高糖YPD培養基中發酵8 d。在發酵結束時測定真正發酵力(耗糖量)。用SPSS大型統計軟件進行極差和方差分析[3]。

1.2.4 固定化酵母與游離酵母發酵性能的比較

(1)固定化酵母的發酵試驗:將海藻酸鈉固定化后的耐鹽酵母凝膠珠按10%(v/v)接種量置于200 mL高糖YPD培養基中,在28℃下靜止培養。

發酵至規定時間后,濾出固定化耐鹽酵母,測定耗糖量。將發酵液倒入蒸餾瓶中蒸餾,截取100 mL蒸餾液,用酒精計測量乙醇體積分數和溫度,并校正為20℃下的乙醇體積分數。

(2)游離酵母的發酵試驗:將耐鹽酵母菌懸液10%(v/v)接種量直接添加于200 mL高糖YPD培養基中,在28℃下靜止培養后測定耗糖量及酒精度。

1.2.5 分析測定項目及方法

(1)固定化耐鹽酵母機械強度的測定[4]:取30個固定化耐鹽酵母顆粒,測定使其變形一半時所需的壓力。

(2)乙醇生成量的測定:蒸餾后用酒精計測量[5]。

(3)糖含量的測定:用斐林試劑法測定發酵液的糖度[6]。

真正發酵力=(發酵液初始糖度-發酵結束后發酵液殘糖度)/發酵液初始糖度

(4)細胞固定效果測定:于波長650 nm下,用721型分光光度計測定發酵液的透光率確定。

2 結果與分析

2.1 固定化載體的選擇

固定化顆粒的強度是影響其應用的重要因素。從固定化強度來分析,海藻酸鈣固定化的效果優于瓊脂和明膠的固定化,見表2。比較海藻酸鈣固定法和瓊脂固定法,由于海藻酸鈣中大量的陽離子Ca2+與酵母細胞壁及膜上的陰離子集團結合緊密,使細胞不易逸出。而瓊脂為非極性大分子多糖,其凝膠環境不利于和酵母菌結合,使得相當一部分細胞逸出凝膠,因而海藻酸鈣固定化優于瓊脂固定化的效果。

使用固定化耐鹽酵母時,酵母細胞應牢固地包埋在凝膠中,避免細胞游離逸出,使發酵液保持澄清,容易分離。在發酵液中,游離的細胞愈多,則發酵液的透光率越低。從透光率分析是海藻酸鈣的包埋效果最好,瓊脂其次,明膠的包埋效果最差。從真正發酵力來看海藻酸鈣固定化的發酵力比瓊脂和明膠固定化的要小,說明細胞游離逸出較慢。綜合考慮,選擇海藻酸鈣作為固定耐鹽酵母的載體。

表2 不同固定化方法的固定效果比較

2.2 耐鹽酵母細胞固定化條件分析

海藻酸鈉是從海藻提取獲取的藻酸鹽,為 D-甘露糖醛酸和古洛糖醛酸的線性共聚物,多價陽離子(如 Ca2+)可誘導凝膠。Ca2+是決定海藻酸鈣固定化酵母機械強度的重要因素,隨著 Ca2+濃度的增加,固定化酵母的強度增加,適宜的海藻酸鈉的濃度使凝膠相對滲透性能好,有利于底物的進入和產物排出,因此,利于耐鹽酵母細胞的發酵作用。

從極差分析結果可以看出,三個試驗因素對固定化耐鹽酵母真正發酵力的影響主次順序為海藻酸鈉濃度 B>氯化鈣濃度 A>發酵溫度 C,即海藻酸鈉濃度對固定化酵母的發酵性能影響最大,其次是氯化鈣濃度,發酵溫度影響最小。

表3 固定化條件的優化試驗結果極差分析

表4 固定化條件的優化試驗結果方差分析

表5 方差分析表

通過極差和方差分析可以看出影響固定化耐鹽酵母發酵力的因素——海藻酸鈉濃度 B 、氯化鈣濃度A、發酵溫度C,其最優的組合為 A2B2C2或A2B2C1,即氯化鈣濃度為1.4 mol/L,海藻酸鈉濃度為4 g/100 mL,發酵溫度為30℃或28℃時,耐鹽酵母的固定化效果最為理想。從實際操作和經濟角度綜合考慮,發酵溫度選取28℃為好。

2.3 固定化耐鹽酵母與游離耐鹽酵母發酵性能的比較

固定化耐鹽酵母和游離耐鹽酵母在28℃下發酵21 d的耗糖變化見圖1,發酵終了時,相應的乙醇生成量及殘糖量見表6。

圖1 固定化耐鹽酵母與游離耐鹽酵母發酵特性曲線

表6 固定化耐鹽酵母與游離耐鹽酵母產乙醇能力及殘糖量的比較

耐鹽酵母有延遲發酵的特性,對蔗糖的利用較遲緩,所以試驗中以葡萄糖為主要碳源。游離耐鹽酵母發酵時,需要有較長的適應期和增殖期,因此,其發酵速度較慢,如圖1所示,發酵終結時,殘糖量為4.25 g/100 mL,而乙醇量為5.6%(v/v),在正常發酵過程中,由于產物的積累,底物的消耗,大大的改變了生長環境,因此,余下的4.25%(w/v)的糖很難發酵。而固定化的耐鹽酵母,由于其酵母集中,又相對處于比較低鹽的環境,因而適應期就大大縮短,發酵速度有明顯的提高多,發酵終結時,殘糖量為3.36 g/100 mL。特別是在發酵前期,即發酵前5 d,這主要是因為此時細胞活性高,底物供應充足,產物濃度很低。因此,發酵速度較快。

3 結論

比較海藻酸鈣、瓊脂、明膠固定化效果,對耐鹽酵母來說,海藻酸鈣的固定化效果最為理想。水平正交試驗表明影響固定化耐鹽酵母真正發酵力因素的主次順序為海藻酸鈉濃度B>氯化鈣濃度A>發酵溫度C,其優化的條件為氯化鈣濃度1.4 mol/L,海藻酸鈉濃度4%(w/v),發酵溫度為28℃時。固定化耐鹽酵母的發酵速度較游離耐鹽酵母快,產醇效率固定化耐鹽酵母較游離耐鹽酵母高0.5%。

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ABSTRACTIn order to get the best carrier,we used different materials to immobilize the salt-tolerant yeast.The optimalimmobilization parameterswere studied by orthogonal experiments,and range analysis and variance analysis were done by using SPSS.The final result showed the sodium alginate and calcium chloride were better than agar and gelatin in immobilization of the salt-resistance yeast.The optimum conditionswere the concentration of sodium alginate4g/100 mL,calcium chloride 1.4 mol/L,at 28℃.Under this condition,the effect of immobilization was better.

Key wordssalt-resistance yeast,immobilization,carrier,real fermenting ability

Prel im inary Research on the I mmobilization of Salt-tolerantYeast

Yang Qiu-ming1,Guo Cai-hua1,Cai Hui-nong1,Wang Zhang2
1(College of Biotechnology,JimeiUniversity,Xiamen 361021,China)
2(China National Institute of Food and Fermentation Industries,Beijing 100027,China)

實驗師(蔡慧農教授為通訊作者)。

＊廈門市科技項目資助

2009-12-16,改回日期:2010-02-01