塑料增塑劑對凡納濱對蝦存活、生長和免疫的影響

王興強，曹梅，閻斌倫，馬甡

1.淮海工學院 江蘇省海洋生物技術重點實驗室，連云港222005

2.中國海洋大學 教育部海水養殖重點實驗室，青島266003

塑料增塑劑對凡納濱對蝦存活、生長和免疫的影響

王興強1，*，曹梅1，閻斌倫1，馬甡2

1.淮海工學院 江蘇省海洋生物技術重點實驗室，連云港222005

2.中國海洋大學 教育部海水養殖重點實驗室，青島266003

研究了塑料增塑劑鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）和鄰苯二甲酸二辛酯（DOP）對凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）存活、生長和免疫的影響.96h急性毒性實驗表明，在助溶劑Tween 20的安全濃度范圍內，隨著DMP、DEP、DBP和DOP水平的升高，凡納濱對蝦存活率呈下降趨勢，24h、48h、72h和 96h的 LC50分別為 40.33、35.29、25.48、19.14mg·L-1，30.52、23.45、16.96、15.38mg·L-1，7.51、6.97、6.57、6.06mg·L-1和6.85、5.87、5.01、4.47mg·L-1；DMP、DEP、DBP和DOP對凡納濱對蝦的安全濃度隨塑料增塑劑碳鏈的增加呈下降趨勢，分別為8.11、4.15、1.80和1.29mg·L-1.90d慢性毒性實驗表明，凡納濱對蝦存活率、特定生長率、血清蛋白含量、血清酚氧化酶和超氧化物歧化酶活性均以對照組和0.0400mg·L-1助溶劑Tween 20處理組最高，而且顯著高于1/100倍DMP、DEP、DBP和DOP安全濃度處理組（p＜0.05）.

凡納濱對蝦；塑料增塑劑；存活；生長；免疫

Received 27 February 2009 accepted 18 March 2009

Abstract：The experiments were designed to determine the effects of plastic plasticizers on survival,growth and immune factors of Litopenaeus vannamei.The four commonly used plasticizers were dimethyl phthalate（DMP）,diethyl phthalate（DEP）,di-n-butyl phthalate（DBP）and dioctyl phthalate（DOP）.The result of acute toxicity test for 96h indicated that the survival rate of Litopenaeus vannamei exhibited decreased trend with increasing DMP,DEP,DBP and DOP levels within the safety concentration of co-solvent Tween 20,and LC50at 24h,48h,72h and 96h were 40.33,35.29,25.48 and 19.14mg·L-1;30.52,23.45,16.96 and 15.38mg·L-1;7.51,6.97,6.57 and 6.06mg·L-1;6.85、5.87,5.01 and 4.47mg·L-1,respectively.The safety concentration of DMP,DEP,DBP and DOP decreased with increasing carbon chain,and were 8.11,4.15,1.80 and 1.29mg·L-1,respectively.The result of chronic toxicity test for 90d indicated that the survival rate, specific growth rate,serum protein content,polyphenol oxidase activity and superoxide dismutase activity were high in the control and 0.0400mg·L-1co-solvent Tween 20 treatment,which were significantly higher than the treatments of 1/100 safety concentration of DMP,DEP,DBP and DOP.

Keywords：Litopenaeus vannamei；plastic plasticizer;survival；growth；immune factors

1 引言（Introduction）

鄰苯二甲酸酯類化合物（Phthalic Acid Easters，PAEs）又稱酞酸酯，其中有8種在工業上用作增塑劑，以增加塑料及橡膠制品的可塑性.在塑料中，PAEs與聚烯烴類塑料分子之間由氫鍵或范德華力連接，彼此保留各自相對獨立的化學性質，隨著時間的推移，可由塑料中遷移到外環境，造成對空氣、水和土壤的污染（Ching et al.,1981）.有關PAEs對水生生物毒性的研究，國內外已有比較多的報道，但主要集中于PAEs對浮游動物、魚類等敏感生物的生長、繁殖等生理功能的影響，對蝦類的報道相對較少（Vivian,1986;Warren et al., 2003;Horn et al.,2004）.塑料制品在對蝦養殖中廣泛應用，如在苗種生產上常用塑料薄膜纏裹培育池中的加熱管道，在苗種和養殖生產上常用塑料管道輸水等.塑料制品在高溫條件下可產生有毒物質，對對蝦危害很大.馬甡等（1997）研究發現，在水中加熱塑料薄膜后水中的化學需氧量顯著上升，推測可能與有大量惡化化學物質溶出有關.凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）是我國海水養殖業重要種類之一，但近年來，由于水質污染，其種質出現退化，疾病流行，對蝦養殖業損失重大.鑒于此，本文探討了幾種常用塑料增塑劑對凡納濱對蝦存活、生長和免疫的影響.

2 材料與方法（Materials and methods）

實驗于2008年5月至11月份在江蘇省海洋生物技術重點實驗室進行.凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei），平均濕體重（0.625±0.386）g，購自贛榆縣海洋源育苗廠.對蝦在一個玻璃纖維水槽（200cm×200cm×100cm）中暫養，水溫23.5～25.0℃，鹽度31.

2.1 急性毒性實驗

實驗采用單因素設計，助溶劑Tween 20、鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）和鄰苯二甲酸二辛酯（DOP）設計梯度見表1.每個水族箱（30cm× 40cm×50cm，養殖水體50L）放養5尾對蝦，每個處理設3個重復，鹽度31，水溫（25.0±0.1）℃，實驗周期96h.

表1 急性毒性實驗濃度梯度Table 1 Concentration gradient of acute experiment

2.2 慢性毒性實驗

在急性毒理實驗結果的基礎上，實驗設6個處理，分別為鹽度31海水對照組、0.0400mg·L-1助溶劑 Tween 20處理組、1/100倍塑料增塑劑 DMP、DEP、DBP和DOP安全濃度處理組（1/100 DMP處理組：1/100倍 DMP安全濃度+0.0400mg·L-1Tween 20，即0.0811mg·L-1DMP+0.0400mg·L-1Tween 20；1/100 DEP、1/100 DBP和1/100 DOP處理組同 DMP處理，即 0.0415mg·L-1DEP+ 0.0400mg·L-1Tween20、0.0180mg·L-1DBP+ 0.0400mg·L-1Tween 20、0.0129mg·L-1DOP+ 0.0400mg·L-1Tween 20），每個水族箱（30cm× 40cm×50cm，養殖水體50L）放養5尾對蝦，每個處理設6個重復.

實驗前停食24h，用電子天平稱其初始體重.飼料為福建馬尾生產的“海馬”牌人工配合飼料，其粗蛋白、脂肪、灰分和含水量分別為（38.07± 0.37）%、（9.81±0.24）%、（12.21±0.32）%和（4.45± 0.57）%.日投餌兩次（06：00和18：00），過量投餌；投餌2.5h后從每個水族箱收集殘餌和糞便.為維持實驗期間水族箱內所設塑料增塑劑濃度的穩定性，每隔3d，水族箱徹底換水一次，實驗周期90d.實驗期間，鹽度保持在31，溶解氧6.0mg·L-1以上，pH 7.7～8.2，水溫（25.0±0.1）℃.

實驗結束后，對每個水族箱中的凡納濱對蝦再次進行計數和稱重；每個水族箱取3～5尾對蝦，取血時用1mL無菌注射器，按照血淋巴與抗凝劑（0.01mol·L-1Tris-HCl，0.25mol·L-1蔗糖，0.1mol·L-1檸檬酸三鈉；pH 7.6；780mOs·kg-1）1：2的比例，自對蝦頭胸甲后插入心臟抽取血液，合并置于無菌Eppendorf管.所取抗凝血，一部分離心10min（700×g，4℃）（MIKR022R，德國HEYYICH公司），所得的上清液一部分用于血清酚氧化酶（PO）活力的測定，另一部分于-20℃冰箱中保存，用于血清蛋白含量和超氧化物歧化酶（SOD）的測定.

2.3 免疫指標的測定

2.3.1 血清蛋白含量

應用總蛋白定量測試盒（南京建成生物工程研究所生產），反應于96孔酶標板中，用酶標儀測量各反應體在595nm波長下OD值.

2.3.2 PO活力的測定

以L-DOPA為底物，采用改進的Ashida方法（雷質文等，2001;Ashida,1971）在96孔酶標板中進行.把10μL血清加入96孔酶標板中，然后向各孔中加入 200μL 0.1mol·L-1pH 6.0磷酸鹽緩沖液，最后向各孔中加入10 μl的L-DOPA（Sigma公司）（0.01 molμL-1）在酶標儀（BIO-TEKSYNERGE，美國Bio公司）中振蕩4次，每隔4min讀取490nm處的吸光值，酶活力以試驗條件下，OD490每分鐘增加0.001為一個酶活力單位.

2.3.3 超氧化物歧化酶（SOD）的測定

應用超氧化物歧化酶（SOD）測試盒（南京建成生物工程研究所生產），反應于96孔酶標板中，用酶標儀測量各反應體在550nm波長下OD值.

2.4 數據處理與計算

所得數據用單因素方差分析、Turkey’s多重比較，以p＜0.05作為差異顯著水平.安全濃度（Sc）以下式計算：

式中：LC50為半致死濃度.特定生長率（SGR）的計算公式為：

式中W1和W2分別為凡納濱對蝦的初體重和末體重（濕重）；t為實驗周期.

3 結果與分析（Results and analysis）

3.1 急性毒性實驗

Tween 20是一種非離子表面活性劑，因為PAEs在水中的溶解度很小，利用表面活性劑的兩親性性質和乳化作用，增大PAEs在水中的溶解度.張春榮等（2004）研究發現，適量的Tween 20有利于提高細胞某些酶的穩定性和催化能力，但高濃度的Tween 20可抑制細胞的活力.由表2可以看出，隨著Tween 20水平的升高，凡納濱對蝦存活率呈下降趨勢；在24h、48h、72h和96h，LC50分別為129.62、110.08、80.47、70.21mg·L-1，安全濃度為23.82mg·L-1，表明Tween 20對凡納濱對蝦有一定的毒性.

表2 Tween 20對凡納濱對蝦存活率的影響（Mean±SD）Table 2 The effect of Tween 20 on survival of Litopenaeus vanname（iMean±SD）

由表3～表6可以看出，在助溶劑Tween 20的安全濃度范圍內，隨著DMP、DEP、DBP和DOP水平的升高，凡納濱對蝦存活率呈下降趨勢，24h、 48h、72h和96h的LC50分別為40.33、35.29、25.48、19.14mg·L-1，30.52、23.45、16.96、15.38mg·L-1，7.51、6.97、6.57、6.06mg·L-1和 6.85、5.87、5.01、4.47mg·L-1；安全濃度分別為 8.11、4.15、1.80和1.29mg·L-1，表明隨碳鏈的增加，塑料增塑劑對凡納濱對蝦的急性毒性呈增大趨勢.與本研究相似，Call等（2001）研究發現，DMP、DEP和 DBP對 Hyalella azteca的LC50分別為28.1、4.21和0.63mg·L-1，而對Chironomus tentans的LC50分別為68.2、31.0和2.64mg·L-1，與本研究結果具有可比性.

表3 鄰苯二甲酸二甲酯對凡納濱對蝦存活率的影響（Mean±SD）Table 3 The effect of dimethyl phthalate on survival of Litopenaeus vannamei（Mean±SD）

表4 鄰苯二甲酸二乙酯對凡納濱對蝦存活率的影響（Mean±SD）Table 4 The effect of diethyl phthalate on survival of Litopenaeus vannamei（Mean±SD）

表5 鄰苯二甲酸二丁酯對凡納濱對蝦存活率的影響（Mean±SD）Table 5 The effect of di-n-butyl phthalate on survival of Litopenaeus vannamei（Mean±SD）

表6 鄰苯二甲酸二辛酯對凡納濱對蝦存活率的影響（Mean±SD）Table 6 The effect of dioctyl phthalate on survival of Litopenaeus vannamei（Mean±SD）

3.2 慢性毒性實驗

據2000年的一項調查顯示，國外的海洋表層水和淡水中PAEs含量在0.1～300.0 μg·L-1之間，我國大的江河湖泊、水庫、飲用水、大氣、土壤底泥中也均不同程度地檢出PAEs（Warren et al.,2003; Vivian,1986）.PAEs易溶于脂肪和有機溶劑，有較強的生物富集作用和一定強度的抗降解能力，而某些水生物對PAEs有驚人的濃縮作用.例如，蝦在含鄰苯二甲酸二異辛酯0.11μg·L-1的水中生活兩周后，體內鄰苯二甲酸二異辛酯的含量可高達1.34mg·L-1，濃縮了大約12000倍；水體幼蟲在濃度為0.18μg·L-1的DBP中暴露7d后，體內DBP濃縮了大約 6000倍（Sung et al.,2003;Defoe et al.,1990）；李瀟等（2008）研究發現，DBP在珠江三角洲地區鯽魚、草魚和羅非魚3種魚類體內的含量在3～10mg·kg-1之間.生物富集是造成慢性毒害、引起器質性病變和影響生理機能的重要因素（李學彬等，2008;Thurén and Woin,1991）.在含鄰苯二甲酸二異辛酯劑量為3、10和30μg·L-1的水體中，大型蚤在兩周內的繁殖量比正常情況分別減少60%、70%和80%（戰宇明，2004）.本研究中，經過90d的養殖實驗發現：凡納濱對蝦存活率和特定生長率以對照組和0.0400mg·L-1助溶劑Tween 20處理組最高，而且顯著高于 1/100倍 DMP、DEP、DBP和DOP安全濃度處理組（p＜0.05；表7）.同樣，林玲等（2008）研究了DBP對斑馬魚胚胎發育毒性的影響，發現625μg·L-1以上劑量的DBP染毒能導致斑馬魚胚胎發育遲緩.如果這些有害物質，通過生物的吸收，并由食物鏈進一步傳遞和富集，最終將會影響到人類健康.

PAEs還會影響水生生物的免疫系統（Chen and Sung,2004）.李文英等（2007）等對數濃度差設置4個質量濃度0.38、0.85、1.90和4.25mg·L-1進行20d慢性染毒，發現隨DBP濃度增大和暴露時間延長，斑馬魚肝臟、鰓中SOD和ATPase活性均顯著受到抑制.血清蛋白含量、PO、SOD等是表征對蝦免疫狀態的重要指標.對蝦生活在一個具有潛在危害的水體環境中，由于其尚不具備特異性的免疫系統，為保護自身免受傷害，機體形成了各種非特異性的免疫保護體系，但是當環境劇烈變化時，免疫系統崩潰，會造成對蝦大規模死亡.已有許多研究表明，在環境脅迫條件下，對蝦的血細胞數量減少，與抗病力有關的酶活力降低，對病原體的易感性提高（Chen and Chang,1993; Perazzolo et al.,2002）.90d的慢性毒理實驗表明，凡納濱對蝦血清蛋白含量、血清酚氧化酶和超氧化物歧化酶活性均以對照組和0.0400mg·L-1助溶劑Tween 20處理組最高，而且顯著高于1/100倍DMP、DEP、DBP和DOP安全濃度處理組（p＜0.05）（圖1～圖3）.這可能是由于對蝦處于應激狀態，一方面需要消耗對蝦體內的免疫因子，從而導致免疫因子活力下降，血清蛋白含量、血清酚氧化酶和超氧化物歧化酶活性降低；另一方面對蝦生理機能失調，從而使得蝦體對病原菌的易感性提高，對蝦存活率降低，生長速度減緩.

表7 塑料增塑劑對凡納濱對蝦存活和生長的影響（Mean±SD）Table 7 The effect of plastic plasticizer on survival and growth of Litopenaeus vannamei（Mean±SD）

綜合以上研究得到如下結論：

1）在助溶劑Tween 20的安全濃度范圍內，隨著DMP、DEP、DBP和DOP水平的升高，凡納濱對蝦存活率呈下降趨勢；隨碳鏈的增加，塑料增塑劑對凡納濱對蝦的急性毒性呈增大趨勢.

2）凡納濱對蝦長期處于DMP、DEP、DBP和DOP低濃度條件下，可導致對蝦處于應激狀態，一方面需要消耗對蝦體內的免疫因子，從而導致免疫因子活力下降，血清蛋白含量、血清酚氧化酶和超氧化物歧化酶活性降低；另一方面對蝦生理機能失調，從而使得蝦體對病原菌的易感性提高，對蝦存活率降低，生長速度減緩.

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EffectsofPlasticPlasticizersonSurvival,Growth and Immune Factors of Litopenaeus vannamei

WANG Xing-qiang1，*，CAO Mei1，YAN Bin-lun1，MA Shen2
1.Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology,Huaihai Institute of Technology,Lianyungang 222005
2.Key Laboratory of Mariculture,Ministry of Education,Ocean University of China,Qingdao 266003

1673-5897（2010）1-069-07

X174，S968.22

A

王興強（1975—），男，博士，副教授，主要從事水生動物生理生態研究.

2009-02-27 錄用日期：2009-03-18

“十一五”國家科技支撐計劃重大項目（No.2006BAD09A01;No.2006BAD09A06）；江蘇省自然科學基金項目（No.BK2006548）；江蘇省教育廳“青藍工程”項目（No.QN07008）

王興強（1975—），男，副教授，博士；*通訊作者（Corresponding author），E-mail:xqwangcaomei@yahoo.com.cn