8種常見農藥對海膽胚胎各發育期的急性毒性

李嬌，王姮，韓昭衡，石生寶，王永華，丁君

大連海洋大學 農業部海洋水產增養殖學與生物技術重點開放實驗室，大連116023

8種常見農藥對海膽胚胎各發育期的急性毒性

李嬌，王姮，韓昭衡，石生寶，王永華，丁君*

大連海洋大學 農業部海洋水產增養殖學與生物技術重點開放實驗室，大連116023

為初步探討農藥對海膽胚胎的急性毒性效應，以蝦夷馬糞海膽（Strongylocentyotus internedius）為實驗材料，研究了 8種常見農藥——草甘膦（Glyphosate）、百草枯（Paraquat）、異菌脲（Iprodione）、代森錳鋅（Mancozeb）、三唑醇（Triadimenol）、霜霉威（Propamocarb）、百菌清（Chlorothalonil）和速克靈（Procymidone）對海膽胚胎各發育期（二細胞期、四細胞期、上浮囊胚期、原腸期、棱柱幼體期、四腕幼蟲期）的半數效應濃度（EC50），并分析了正辛醇/水分配系數（LogP）與EC50的關系.結果顯示：1）8種農藥對海膽胚胎各發育期均具有一定的急性毒性，以四腕幼蟲期為例，8種農藥的EC50值分別為草甘膦（3.99mg·L-1）＞百草枯（10.38mg·L-1）＞代森錳鋅（20.77mg·L-1）＞速克靈（55.42mg·L-1）＞霜霉威（56.09mg·L-1）＞異菌脲（86.29mg·L-1）＞三唑醇（273.20mg·L-1）＞百菌清（647.38mg·L-1）.2）LogP與EC50呈現一定的正相關性，即隨著LogP的增加，各農藥對海膽胚胎的抑制率逐漸降低.

農藥；蝦夷馬糞海膽；胚胎發育；毒性影響

Received 10 December 2009 accepted 16 January 2010

Abstract：Toxic effects of commonly used eight pesticides（Glyphosate,Paraquat,Iprodione,Mancozeb,Triadimenol, Propamocarb,Daconil and Sumilex）on the embryo development of the sea urchin Strongylocentrotus intermedius were evaluated in this work.Toxicity was quantified in terms of the EC50（median effective concentration）on the six early developmental stages of sea urchin embryo（2-cell,4-cell,blastula,gastrula,prism,and 4-arm pluteus）.Then the concentration—response curves for each pesticide and the relationship between octanol/water partition coefficient（logP）and EC50of each embryonic development stage were surveyed and analysed.Results showed that 1）all the eight pesticides had toxic effects on the whole embryo development,comparing the EC50values of each pescide at the 4-arm pluteus stage, they were ranked in decreasing order of toxicity EC50as follows:Glyphosate（3.99mg·L-1）＞Paraquat（10.38mg·L-1）＞Mancozeb（20.77mg·L-1）＞Procymidone（55.42mg·L-1）＞Propamocarb（56.09mg·L-1）＞Iprodione（86.29mg·L-1）＞Triadimenol（273.20mg·L-1）＞Chlorothalonil（647.38mg·L-1）.2）There was a positive correlation between the LogP and EC50of each stage,i.e.as the value of logP increasing,the inhibition rate of the pesticides on the embryos decreased.

Keywords：pesticide；Strongylocentyotus internedius；embryo development；toxicity

1 引言（Introduction）

隨著工農業生產的發展，近年來農藥的用量不斷增加.農藥在殺滅病蟲害、提高農作物產量的同時也會造成嚴重的環境污染.研究表明，農藥可直接或間接危害人類和其他生物健康，對生殖系統和胚胎發育具有顯著影響（Manzo et al.,2005）.海洋處于地球的最低處，陸地上的各種污染物最終都將進入海洋（劉維屏，2006）.農藥可通過河流、降水、地下水等多種途徑進入海洋，進而導致浮游動、植物及其他水生生物生理、生態、品種和數量的變化，嚴重影響海洋生態系統的健康（岳文潔等，2009;何忠文等，2009）.因此，研究農藥對海洋生物的毒性作用具有重要意義.然而，與陸生生物相比，農藥對海洋生物的毒性效應研究尚較為缺乏（孫雪峰等，2009）.

海膽屬于后口動物，具有個體相對小、生命力強、適應性廣、在實驗室控制條件下容易飼養、繁殖周期相對短、能分批產卵或連續產卵、產卵量大等特點，在海洋生物學實驗中具有廣泛應用，并已成為海洋生態毒理學研究的模式生物（Semenova et al.,2006;Berdyshev et al.,1995）.胚胎期和幼蟲期是海膽生命中對污染物最敏感的時期，目前日本、加拿大和美國等國家已廣泛采用海膽胚胎和幼蟲來檢測重金屬的毒性和監測海洋環境的污染狀況（His et al.,1999;Ringwood,1991;Carr et al., 1995;Beiras et al.,2003;Bellas et al.,2003;Bellas et al.,2005;Marc et al.,2002;Phillips et al.,2003; Hamdoun et al.,2002;Larrain et al.,1999;Woodworth et al.,1999;Kobayashi and Okamura,2005）.然而以海膽胚胎和幼蟲為受試對象檢測常見農藥的毒性尚不多見，國內僅有孫雪峰等（2009）進行了初步研究.本研究在此基礎上，以蝦夷馬糞海膽（Strongylocentyotus internedius）為實驗材料，研究了8種農藥對海膽胚胎的急性毒性，得到了8種農藥對海膽胚胎各發育期的半數效應濃度即EC50值，填補了常見農藥對海膽胚胎急性毒性數據的空白，為深入研究農藥對海洋生物的影響，制定完善的環境排放標準及風險管理提供了基礎毒理學依據.

2 材料與方法（Materials and methods）

2.1 材料

試驗用蝦夷馬糞海膽（Strongylocentyotus internedius）取自大連水產學院重點實驗室，殼徑3.6～4.8cm，殼高2.2～3.1cm.試驗用海水取自大連黑石礁附近海域，經過砂濾池過濾，鹽度32.2± 0.3，pH 8.13±0.5.

8種受試農藥為草甘膦（Glyphosate）、百草枯（Paraquat）、異菌脲（Iprodione）、代森錳鋅（Mancozeb）、三唑醇（Triadimenol）、霜霉威（Propamocarb）、百菌清（Chlorothalonil）和速克靈（Procymidone），購自中國藥品生物制品檢定所，均為標準品.

2.2 方法

2.2.1 藥物濃度的設定

將農藥溶于新鮮海水中配得母液，再由母液稀釋到實驗所需濃度.先按照急性毒性試驗方法進行預試驗，確定海膽胚胎發育從受精到四腕幼蟲全死和不死的劑量范圍，根據預實驗設定實驗濃度：草甘膦（11個梯度）（mg·L-1）：0.1、0.5、0.8、1、4、6、8、10、20、30、50；百草枯（8個梯度）（mg·L-1）：1、3、5、8、10、20、40、60；異菌脲（7個梯度）（mg·L-1）：5、10、30、60、90、120、150；代森錳鋅（7個梯度）（mg·L-1）：20、60、100、120、150、200、220；三唑醇（7個梯度）（mg·L-1）：100、300、500、800、1000、1300、1500；霜霉威（8個梯度）（mg·L-1）：1、5、8、10、20、50、70、100；百菌清（6個梯度）（mg·L-1）：100、500、1000、3000、5000、7000；速克靈（9個梯度）（mg·L-1）：10、20、40、60、80、100、120、150、200.每種藥物每個濃度設3個平行，1個對照組，對照組為過濾海水.

2.2.2 配子的獲得及人工授精

挑選活力好、大小均一的海膽，采用KCl注射法（KCl濃度為0.5mol·L-1，注射1mL）催產獲得精子和卵（常亞青等，2004）.將排精的雄海膽換入干的培養皿，以收集純凈的精液原液備用.將排卵的雌海膽放入盛有海水的三角燒瓶中，反口面向下，使海水淹蓋生殖孔，讓卵直接排入海水中，排出的卵逐漸沉入燒瓶底，顯微鏡下觀察卵子的質量和精子的活性.卵子用篩絹網過濾，將精、卵直接于實驗溶液中授精.

2.2.3 毒性實驗

受精之后洗卵兩次，在盛有200mL實驗溶液的250mL燒杯中發育，受精卵的密度大致為100～150個·mL-1，觀察胚胎發育過程.實驗過程中選取6個發育期進行觀察，分別為：二細胞期、四細胞期、上浮囊胚期、原腸期、棱柱幼體期和四腕幼蟲期，觀察記錄各藥物對海膽這6個發育期的影響情況.受精后即觀察對照組的受精情況，確保實驗在90%以上的卵正常受精的情況下進行.本實驗條件下，對照組發育到二細胞需要1.5h，發育到四細胞需要2.5h，發育到上浮囊胚需要16.5h，發育到原腸需要28.5h，發育到棱柱幼體需要41h，發育到四腕幼蟲需要52h.觀察時，每個平行隨機抽取100左右的個體，用5%甲醛固定，計數.正常進入各發育期的計為正常個體，發育延滯、畸形及死亡個體計為被抑制個體.

實驗過程中間隔性充氣，以保證有充足的氧氣進入實驗水體，水溫控制在18℃.

2.3 數據分析

2.3.1 EC50值的計算

檢查并統計各實驗組海膽胚胎發育期的抑制率.利用SPSS 13.0軟件計算農藥對海膽胚胎各發育期的EC50值.

2.3.2 LogP與EC50的相關性分析

利用Chmeoffice軟件計算出8種農藥的LogP值，利用SPSS 13.0軟件對LogP與EC50的相關性進行作圖并分析.

3 結果與分析（Results and analysis）

3.1 8種農藥對海膽胚胎各發育期的急性毒性

3.1.1 EC50值

8種農藥對海膽胚胎各發育期的EC50值如表1所示.由表1可見，百菌清對海膽胚胎各發育期的EC50值在8種農藥中均為最大；二細胞期EC50值最小的是百草枯；其他各發育期EC50最小的是草甘膦；霜霉威和代森錳鋅對于二細胞期的抑制率隨濃度變化不明顯且低，因此未計算出這兩種農藥對二細胞期的EC50值.

以四腕幼蟲期的EC50值來看，8種農藥的毒性大小依次為草甘膦＞百草枯＞代森錳鋅＞速克靈＞霜霉威＞異菌脲＞三唑醇＞百菌清.

表1 8種農藥對海膽胚胎各發育期的EC50值Table 1 EC50values of eight pesticides for the development of sea urchin embryos

3.1.2 海膽胚胎各發育期對農藥的敏感性

EC50值隨海膽胚胎各發育期的變化如圖1所示.由圖1可見，隨著胚胎的發育，EC50逐漸降低，農藥對胚胎的毒性逐漸增強，表明隨著海膽胚胎的發育，其對農藥的敏感性增強，其中四腕幼蟲期最敏感，耐受性最低.

圖1 EC50值與海膽胚胎各發育期的關系Fig.1 Relationships between EC50values and sea urchin embryo development periods

海膽胚胎不同發育期對農藥的耐受能力不同，可能主要與不同發育期的生理結構有關，上浮囊胚期之前的海膽胚胎有卵膜包裹，對毒性抵抗能力強，原腸期腸道打開，對藥物抵抗力下降，到了棱柱期和四腕期胚胎完全暴露于藥液中，以至于很小的濃度就能引起抑制.

3.2 LogP值及其與EC50值的相關性分析

8種農藥的LogP及結構式如表2所示.

以農藥的LogP值為橫坐標，以農藥對海膽胚胎各發育期的EC50值為縱坐標，對LogP與EC50值的關系作圖.如圖2所示，隨著農藥LogP的升高，各農藥對不同發育期胚胎的EC50均呈逐漸上升趨勢.回歸分析表明，原腸期和棱柱期的 EC50與 LogP有較好的正相關關系（p＜0.05）.

LogP是指平衡狀態下化合物在正辛醇和水相中濃度的比值，它反映了化合物在水相和有機相之間的遷移能力，表征的是化合物的親脂性（何藝兵等，1994）.

化合物要對機體產生毒害作用，首先必須通過機體的細胞膜才能與目標分子作用.細胞膜由磷脂雙分子層組成，親脂性的化合物比親水性的化合物更容易通過這一層細胞膜，因此細胞對藥物的吸收通常隨分配系數（LogP）的增加而增大（吳義輝等，2000），即LogP值越大，該化合物就越容易通過細胞膜，就可能對有機體造成更大的危害.理論上分子中氯原子數越多，分子的極性越小，其LogP的值越大，它對機體所造成的危害也可能越大（Richard and Hunter,1996）.

表2 8種農藥的LogP值Table 2 LogP values of eight pesticides

圖2 LogP與海膽胚胎各發育期EC50的關系Fig.2 Relationships between LogP values and EC50values during different sea urchin embryo development periods

然而，本實驗結果發現EC50值與LogP呈正相關，即隨著LogP的增大對海膽胚胎的毒性變小，與上述分析相反，此結果與孫雪峰等（2009）對光棘球海膽胚胎毒性試驗中的現象一致.這可能與海膽胚胎細胞特殊的結構和物質組成有關，也可能與農藥在海水中與生物作用機制的不同有關（孫雪峰等，2009），還可能與LogP本身有關.分配系數LogP值是對分子整體疏水性質的定量表示，但不能描述分子的局域疏水性，而局域疏水性對于確定受體的活性位點和藥物分子的藥效團非常重要（Kubinyi,1993）.對于海膽胚胎而言，EC50值與農藥LogP呈正相關性產生的具體機制目前尚不清楚，有待進一步深入研究.

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LI Jiao，WANG Heng，HAN Zhao-heng，SHI Sheng-bao，WANG Yong-hua，DING Jun*
Key Laboratory of Mariculture&Biotechnology,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian 116023

1673-5897（2010）2-255-07

X171.5，X131.3

A

丁君（1973—），女，遼寧遼陽市人，博士，副研究員，主要從事海洋生物技術方面的研究.

2009-12-10 錄用日期：2010-01-16

國家高技術研究發展計劃（863） 項目（No.2006AA10A411）；國家海洋局海洋溢油鑒別與損害評估技術重點實驗室開放基金項目

李嬌（1986—），女，碩士研究生；通訊作者（Corresponding author），E-mail:dingjunlll9@dlfu.edu.cn