氣態(tài)甲醛致小鼠骨髓細(xì)胞DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)的研究

程文文，李蘭，胡傳祿，魏晨曦，楊旭，丁書茂

華中師范大學(xué) 遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430079

氣態(tài)甲醛致小鼠骨髓細(xì)胞DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)的研究

程文文，李蘭，胡傳祿，魏晨曦，楊旭，丁書茂*

華中師范大學(xué) 遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430079

為探討吸入性甲醛能否對小鼠骨髓造血細(xì)胞產(chǎn)生遺傳毒性，以SPF級昆明雄性小鼠為材料，采用動態(tài)吸入方式連續(xù)染毒72h，取骨髓細(xì)胞，測定DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián).結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著甲醛濃度的升高（0、0.5、1.0、3.0mg·m-3），小鼠骨髓細(xì)胞DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)系數(shù)逐漸升高，0.5mg·m-3組與對照組存在顯著差異（p＜0.05），1.0、3.0mg·m-3組與對照組存在極顯著差異（p＜0.01）.表明，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，甲醛對小鼠骨髓細(xì)胞具有一定的遺傳毒性.

甲醛；骨髓細(xì)胞；DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)

Received 30 April 2009 accepted 15 June 2009

Abstract：In order to study the genotoxicity of gaseous formaldehyde（FA）on mouse bone marrow cells,SPF level Kunming male mice were exposed to gaseous formaldehyde for 72h.KCl-SDS assay were applied to detect DNA-protein crosslinks（DPC）in bone marrow cells.Results showed that low concentration（0.5mg·m-3）gaseous formaldehyde could induce DPC formation significantly（compared with the control,p＜0.05）,and high concentrations（1.0，3.0mg·m-3）could induce DPC formation very significantly（p＜0.01）.DPC was increased with the increasing of gaseous formaldehyde concentrations（0.5,1.0,3.0mg·m-3）.The results suggested that among the concentrations investigated in the present study,gaseous formaldehyde had obvious genetic toxicity on the mouse bone marrow cells.

Keywords：formaldehyde；bone marrow；DNA-protein crosslinks

1 引言（Introduction）

甲醛（Formaldehyde）是一種高揮發(fā)性的小分子醛類化合物，環(huán)境中的甲醛主要來自于燃料燃燒、工業(yè)應(yīng)用、裝修材料和各種消費(fèi)品等.目前由室內(nèi)裝修和各種消費(fèi)品的使用所導(dǎo)致的室內(nèi)甲醛濃度上升非常迅速，由甲醛所導(dǎo)致的健康問題已引起國內(nèi)外的普遍關(guān)注（Speit and Merk,2002;Heck and Casanova,2004;崔香麗等，1995）.研究表明，甲醛可通過致組織活性氧增加、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、影響機(jī)體的免疫系統(tǒng)以及與生物大分子作用等使機(jī)體發(fā)生損傷；甲醛對粘膜具有刺激性，可降低機(jī)體的呼吸功能、神經(jīng)系統(tǒng)的信息整合功能并影響機(jī)體的免疫應(yīng)答；對心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等均具有毒性作用，并具有一定的遺傳毒性（徐曉宇等，2008;World Health Organization,2002）.

白血病是骨髓造血細(xì)胞，特別是白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的遺傳物質(zhì)發(fā)生突變后引起的造血組織癌癥，主要侵犯青少年和中青年，病死率很高.由室內(nèi)空氣污染導(dǎo)致的甲醛與白血病的關(guān)系目前已成為國內(nèi)外環(huán)境與健康領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn).由于甲醛及其衍生成分在血液中轉(zhuǎn)移機(jī)制復(fù)雜，且甲醛在骨髓中對微環(huán)境組分的作用機(jī)制尚不明朗，因此甲醛與白血病的關(guān)系目前尚存在爭議（楊旭和丁書茂，2009）.2004年 6月 15日世界衛(wèi)生組織（WHO）下屬的國際癌癥研究局（IARC）發(fā)布了題為“IARC將甲醛分類為人類致癌物”的新聞公報(bào)（IARC,2004），將甲醛確定為A1類物質(zhì)（人類致癌物），并指出甲醛致白血病證據(jù)有力但還不夠充分.

研究表明，氣態(tài)甲醛可誘導(dǎo)肝細(xì)胞、生殖細(xì)胞等多種細(xì)胞DPC的形成（彭光銀等，2006;劉丹丹和王博，2006）；Wang等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，氣態(tài)和液態(tài)甲醛可導(dǎo)致大鼠骨髓細(xì)胞DNA斷裂，引起DPC水平顯著升高；付聰?shù)龋?008）發(fā)現(xiàn)血清能夠再生細(xì)胞內(nèi)的硫醇，同時促進(jìn)甲醛誘導(dǎo)的細(xì)胞DPC的形成.以上這些研究為甲醛具有遠(yuǎn)距離毒性，且能誘導(dǎo)白血病提供了一定的支持.本研究在前期研究基礎(chǔ)上，以昆明小鼠為材料，對氣態(tài)甲醛致骨髓細(xì)胞DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)進(jìn)行進(jìn)一步佐證.

2 材料與方法（Materials and methods）

2.1 材料與試劑以及儀器

純系SPF級昆明小鼠，雄性，體重25g左右，購自湖北省預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心.

10%甲醛溶液（Sigma公司），十二烷基硫酸鈉（Merk公司），蛋白酶K（Merk公司），Hoechst33258熒光染料（Sigma公司），小牛胸腺DNA（Sigma公司），其它試劑均為國產(chǎn)分析純.

F-4500型熒光分光光度計(jì)（Hatachi公司）；WH-2小型智能環(huán)境氣候艙（武漢市宇信科技開發(fā)有限公司）；4160-2型甲醛測定儀（Interscan公司），靈敏度0.012mg·m-3，準(zhǔn)確度±0.024mg·m-3.

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 染毒

實(shí)驗(yàn)采用仿真式暴露染毒（Wang et al.,2009;李睿等，2003）.將20只小鼠，隨機(jī)分為4組：1個對照組和3個甲醛染毒組，每組5只.染毒組在玻璃染毒缸（由8.4L通氣式干燥器改制而成）中連續(xù)動態(tài)染毒72h，甲醛經(jīng)WH-2型小型智能環(huán)境氣候艙調(diào)配后，持續(xù)穩(wěn)定地輸出濃度為 0.5、1.0和3.0mg·m-3的甲醛氣體.艙參數(shù)：氣溫（23±0.5）℃，氣體濕度45%，過艙氣體流量1L·min-1.根據(jù)我國相關(guān)職業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，目前甲醛在工作場所的最高容許濃度為0.5mg·m-3，而在2002年之前的規(guī)定是3mg·m-3.本實(shí)驗(yàn)所設(shè)染毒濃度即依據(jù)這兩種標(biāo)準(zhǔn)而設(shè)定.對照組為在相同條件下的玻璃缸中，吸入經(jīng)過濾的新鮮空氣（甲醛濃度＜0.01mg·m-3）.染毒期間，小鼠自由進(jìn)食和飲水.

2.2.2 制備骨髓沉淀物

染毒結(jié)束后，頸椎脫臼處死小鼠，取出雙側(cè)股骨，用37℃磷酸緩沖液（pH=7.5）5mL沖出骨髓于離心管中，1500rmp離心10min，棄上清液（劉培桐，1997）.

2.2.3 DPC檢測

DPC采用 KCl-SDS沉淀法（Zhitkovich and Costa,1992;黃思佳等，2008）進(jìn)行檢測.首先向樣品中加入SDS，使之與DPC及蛋白質(zhì)結(jié)合，然后加入KCl溶液使DPC和蛋白質(zhì)沉淀，而自由的DNA留在上清液中.將上清液轉(zhuǎn)移后，再向沉淀中加入蛋白酶K除去蛋白質(zhì)，使DPC中的DNA游離出來，用熒光法測定此DNA的含量A（交聯(lián)DNA）以及原液中DNA的含量B（自由DNA），計(jì)算DPC系數(shù)η，以此值表示DNA和蛋白質(zhì)的交聯(lián)程度（徐曉宇等，2008）.η計(jì)算公式為：

具體步驟如下：1）細(xì)胞裂解：用37℃磷酸緩沖液（pH=7.5）0.5mL重懸細(xì)胞并在顯微鏡下計(jì)數(shù)保證細(xì)胞個數(shù)在 106以上，加入 2%的 SDS溶液0.5mL并輕微振蕩，將混合液 65℃水浴加熱10min，裂解細(xì)胞.2）游離DNA的分離：從水浴中取出裂解好的細(xì)胞，加入100μL 2.5mol·L-1的KCl溶液（pH=7.4，10mmol·L-1Tris-HCl配制），將混合液6次穿過1mL的聚丙烯槍頭，使DNA長度統(tǒng)一.冰上冷凍 5min，形成 SDS-K+沉淀后，于10,000rmp、4℃下離心5min收集沉淀，將上清液轉(zhuǎn)入另一個5mL離心管中.沉淀加入1mL清洗緩沖液（0.1mol·L-1KCl，0.1mmol·L-1EDTA，20mmol·L-1Tris-HC1，pH=7.4）重懸，65℃水浴加熱10min，冰上驟冷5min，重復(fù)離心和清洗步驟3次，每次都將上清液轉(zhuǎn)入5mL離心管中.3）DPC中結(jié)合DNA的分離：最終的沉淀重懸于0.5mL清洗緩沖液中，加入0.5mL蛋白酶K（0.2mg·mL-1，溶于清洗緩沖液中配制），50℃水浴中消化 3h，再在冰上驟冷5min，然后于12,000rmp、4℃下離心10min，收集上清液即為DPC中的交聯(lián)DNA.4）DPC定量：先制作DNA濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線.用清洗緩沖液配制終濃度為 0、100、300、500、750、1000、1500、2000、3000、5000ng·mL-1的小牛胸腺DNA標(biāo)準(zhǔn)液，加入1mL新鮮配制的 400ng·mL-1熒光染料 Hoechst33258（20mmol·L-1Tris-HCl配制），使其終濃度為200ng·mL-1，暗處染色30min，用F-4500型熒光分光光度計(jì)在350nm激發(fā)光和450nm發(fā)射光下測得各濃度的熒光值，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）.5）將染色后的樣品用F-4500型熒光分光光度計(jì)測定其熒光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量交聯(lián)DNA和自由DNA，計(jì)算DPC系數(shù).

2.3 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 5.0統(tǒng)計(jì)軟件分析并進(jìn)行t檢驗(yàn)并繪圖.

圖1 DNA濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of DNA concentration

3 結(jié)果（Results）

不同濃度氣態(tài)甲醛染毒下小鼠骨髓細(xì)胞DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)系數(shù)如圖2所示.由圖可見，隨著甲醛濃度的升高（0、0.5、1.0、3.0mg·m-3），小鼠骨髓細(xì)胞DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)系數(shù)逐漸升高，0.5mg·m-3組與對照組存在顯著差異（p＜0.05），1.0、3.0mg·m-3組與對照組存在極顯著差異（p＜0.01）.表明，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，甲醛可顯著誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)物的形成.

圖2 氣態(tài)甲醛致小鼠骨髓細(xì)胞DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)系數(shù)Fig.2 DNA-protein crosslinks induced by different concentrations of gaseous formaldehyde

4 討論（Discussion）

4.1 甲醛與白血病的關(guān)系

甲醛暴露會導(dǎo)致白血病這種觀點(diǎn)首先來自流行病學(xué)研究.2004年，美國職業(yè)安全和健康研究所Pinkerton等調(diào)查了11039名曾在甲醛超標(biāo)環(huán)境中工作3個月以上的工人，發(fā)現(xiàn)有15名死于白血病（Pinkerton et al.,2004）.美國國立癌癥研究所Hauptmann等調(diào)查了甲醛生產(chǎn)工廠25019名工人，發(fā)現(xiàn)有69名死于白血病，死亡比例略高于普通人群，相對危險(xiǎn)度隨著甲醛濃度的增高而增加（Hauptmann et al.,2003）.我國發(fā)布的流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示，我國白血病的自然發(fā)病率較高，每年約新增4萬名白血病患者，其中50%是兒童，而且以2～7歲的兒童居多.家庭裝修導(dǎo)致的室內(nèi)環(huán)境污染，被認(rèn)為是導(dǎo)致城市白血病患兒增多的主要原因.北京兒童醫(yī)院統(tǒng)計(jì)顯示，就診的城市白血病患兒中，有九成以上的患兒家庭在半年內(nèi)裝修過.深圳兒童醫(yī)院與有關(guān)部門曾對新增加的白血病患兒進(jìn)行了家庭居住環(huán)境調(diào)查，發(fā)現(xiàn)90%小患者的家中在半年之內(nèi)裝修過（楊友等，2007）.因此，有學(xué)者推測甲醛暴露可能與白血病的發(fā)生有關(guān)，認(rèn)為甲醛可能引發(fā)白血病（Golden et al.,2006）.

然而有學(xué)者對甲醛暴露導(dǎo)致白血病持反對意見，他們認(rèn)為甲醛不可能具有遠(yuǎn)距離造血毒性，主要原因如下：①甲醛化學(xué)性質(zhì)活潑，高度水溶性，吸入的甲醛可在鼻腔和氣管大量積累；②由于甲醛解毒酶系的作用，甲醛在機(jī)體中迅速被清除.甲醛主要通過甲醛脫氫酶解毒，后者在機(jī)體內(nèi)廣泛分布，包括接觸位點(diǎn)；③甲醛與體內(nèi)分子的反應(yīng)可以降低自由甲醛濃度；④研究也證實(shí)血液中甲醛濃度在暴露之后不變，提示血液是吸入甲醛的屏障（Casanova and Heck,1987;Heck and Casanova, 2004）.Franks（2005）提出了一個評估甲醛在人體內(nèi)被吸收和代謝的數(shù)學(xué)模型，他用這個模型預(yù)測了暴露后血液中甲醛的濃度，結(jié)果表明暴露后甲醛濃度增加不顯著.Casanova-Schmitz等（1984）利用［3H］和［14C］標(biāo)記的氣態(tài)甲醛混合到常規(guī)氣態(tài)甲醛中對小鼠進(jìn)行染毒，與對照組相比，并沒有在骨髓細(xì)胞中檢測出明顯的DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)，因此他們認(rèn)為甲醛暴露不會對骨髓細(xì)胞造成遺傳毒性.然而，支持甲醛暴露能夠?qū)е掳籽〉膶W(xué)者認(rèn)為：甲醛也是體內(nèi)代謝產(chǎn)物，體內(nèi)甲醛的50%～80%以結(jié)合物的形式存在.吸入型甲醛也不例外，甲醛被吸入之后，除了被脫氫酶水解一部分之外，還可能有相當(dāng)數(shù)量的甲醛能與其他生物活性分子結(jié)合，生成結(jié)合態(tài)甲醛.結(jié)合態(tài)甲醛一方面可能具有較強(qiáng)的毒性；另一方面結(jié)合態(tài)甲醛進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)之后，可以傳輸?shù)饺砀魈帲浜笥轴尫懦鲇坞x態(tài)甲醛（王昆等，2006;付聰?shù)龋?008），進(jìn)一步產(chǎn)生毒性作用.

本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)對小鼠進(jìn)行氣態(tài)甲醛連續(xù)染毒后，骨髓細(xì)胞DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)系數(shù)顯著升高.Wang等（2009）研究同樣發(fā)現(xiàn)氣態(tài)甲醛可顯著誘導(dǎo)大鼠骨髓細(xì)胞DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)物的產(chǎn)生，這表明氣態(tài)甲醛對骨髓細(xì)胞具有一定的遺傳毒性.

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Casanova-Schmitz等（1984）的試驗(yàn)結(jié)果不一致.我們認(rèn)為，在 Casanova-Schmitz等的實(shí)驗(yàn)中，可能有兩方面的原因?qū)е鹿撬杓?xì)胞中無DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)的出現(xiàn)：一方面在此實(shí)驗(yàn)中甲醛為間歇性暴露，所以形成的DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)很可能在體內(nèi)修復(fù)機(jī)制的作用下得到較大程度的恢復(fù)（彭光銀等，2006）；另一方面，甲醛為水溶性極強(qiáng)的一種物質(zhì)，在Casanova-Schmitz等的試驗(yàn)中空氣濕度過大（＞95%），所以導(dǎo)致進(jìn)入鼻粘膜和肺部的甲醛實(shí)際濃度偏低，導(dǎo)致甲醛的毒性相對減弱（楊旭和丁書茂，2009）.而在本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)空氣濕度僅為45%，且為連續(xù)暴露，因此在甲醛誘導(dǎo)下出現(xiàn)了明顯的DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián).

4.2 甲醛致白血病的可能機(jī)制

白血病是造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，其特征是骨髓、淋巴結(jié)等造血系統(tǒng)中一種或多種血細(xì)胞成分發(fā)生惡性腫瘤，并浸潤體內(nèi)各臟器組織，導(dǎo)致正常造血細(xì)胞受抑制，產(chǎn)生各種癥狀.白血病的確切病因至今未明，許多因素被認(rèn)為和白血病的發(fā)病有關(guān)，如病毒、遺傳因素、環(huán)境化學(xué)毒物和藥物等因素.在2006年3月，在California州San Diego的社會毒理學(xué)年會上，美國國家環(huán)保總署（EPA）的科學(xué)家發(fā)表了一篇題為《Hypothesized Mode of Action for Formaldehyde-Induced Lymphoid Malignancies》的文章.文章認(rèn)為：工人暴露在甲醛中存在著誘發(fā)淋巴癌和骨髓癌的高風(fēng)險(xiǎn).EPA的科學(xué)家所提出的這種作用模式假說已經(jīng)暗示，吸入甲醛氣體能誘發(fā)各種形式的骨髓癌、淋巴癌、白血病.雖然目前生物學(xué)上還沒有相似的機(jī)制來解釋一種化學(xué)物質(zhì)具有血液毒性或能誘導(dǎo)產(chǎn)生人體的急性骨髓系白血病，但如果這些假設(shè)能被證實(shí)，則將是空前的發(fā)現(xiàn).

Zhang等（2009）提出甲醛致白血病的可能機(jī)制與骨髓細(xì)胞突變有著密切的聯(lián)系：1）甲醛從呼吸系統(tǒng)進(jìn)入血液，從血液再進(jìn)入骨髓，然后同DNA綁定，誘導(dǎo)早期干細(xì)胞變異并最終導(dǎo)致白血病，或者甲醛進(jìn)入骨髓后同大分子綁定，它的毒性效應(yīng)使早期干細(xì)胞發(fā)生病變并導(dǎo)致白血病，也可能甲醛進(jìn)入骨髓后同大分子結(jié)合后誘導(dǎo)早期干細(xì)胞發(fā)生變異并導(dǎo)致白血病.2）甲醛從呼吸系統(tǒng)進(jìn)入血液，然后進(jìn)入血液造血干細(xì)胞循環(huán)系統(tǒng)，同DNA綁定，誘導(dǎo)早期干細(xì)胞變異，或者甲醛進(jìn)入血液后同大分子綁定，它的毒性效應(yīng)使早期干細(xì)胞發(fā)生病變，也可能甲醛進(jìn)入血液后同大分子結(jié)合后誘導(dǎo)早期干細(xì)胞發(fā)生變異.這些變異或者病變的早期干細(xì)胞然后進(jìn)入骨髓導(dǎo)致白血病.3）甲醛進(jìn)入呼吸系統(tǒng)，同DNA綁定，誘導(dǎo)早期干細(xì)胞變異，或者甲醛進(jìn)入呼吸系統(tǒng)后同大分子綁定，它的毒性效應(yīng)使早期干細(xì)胞發(fā)生病變，也可能甲醛進(jìn)入呼吸系統(tǒng)后同大分子結(jié)合后誘導(dǎo)早期干細(xì)胞發(fā)生變異.這些變異或者病變的早期干細(xì)胞然后通過血液進(jìn)入骨髓，導(dǎo)致白血病的發(fā)生.

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了氣態(tài)甲醛能夠?qū)撬杓?xì)胞產(chǎn)生遺傳毒性，導(dǎo)致DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)，這說明氣態(tài)甲醛暴露也有可能對骨髓造血干細(xì)胞造成損傷.在以后的實(shí)驗(yàn)中，我們將針對骨髓造血干細(xì)胞為靶對象，開展甲醛對造血細(xì)胞毒性的研究，希望能為“甲醛暴露是否導(dǎo)致白血病”這個倍受國際科學(xué)家爭議的科學(xué)懸案最終被證明和解決提供科學(xué)依據(jù).

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Gaseous Formaldehyde-Induced DNA-Protein Crosslinks in Mouse Bone Marrow Cells

CHENG Wen-wen，LI Lan，HU Chuan-lu，WEI Chen-xi，YANG Xu，DING Shu-mao*

Hubei Key laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology,Huazhong Normal University,Wuhan 430079

1673-5897（2010）2-262-06

X131，X171.5

A

丁書茂（1966—），男，華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院副教授，碩士生導(dǎo)師.主要從事生物化學(xué)和分子生物學(xué)及生態(tài)毒理學(xué)研究.Tel:027-67867774.

2009-04-30 錄用日期：2009-06-15

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（No.2006BAJ02A10）

程文文（1983─），男，碩士研究生；*通訊作者（Corresponding author），E-mail:dingsm@mail.ccnu.edu.cn