底泥水體中適用于PCR的不同形態DNA的提取方法

馮凌，羅義

南開大學環境科學與工程學院 環境污染過程與基準教育部重點實驗室，天津300071

底泥水體中適用于PCR的不同形態DNA的提取方法

馮凌，羅義*

南開大學環境科學與工程學院 環境污染過程與基準教育部重點實驗室，天津300071

提出直接從環境河流底泥和表層水體中同時提取不同形態DNA（胞內、胞外、染色體和質粒DNA）的有效方法.利用該方法提取了海河典型區域底泥的胞外DNA和胞內DNA及水體中細菌染色體DNA和質粒DNA.結果表明，NaH2PO4提取的胞外DNA分子量大于1kb，提取率40%～72%，沒有共提取胞內DNA.胞內DNA提取的分子量均大于23.1kb，細菌質粒DNA與染色體DNA同時分離.16S rDNA與sul2擴增驗證提取方法可靠性.16S rDNA擴增結果顯示所有胞外DNA呈陰性，胞內DNA呈陽性.質粒DNA和染色體DNA的16S rDNA擴增顯示，染色體DNA結果顯陽性，質粒DNA呈陰性，sul2的結果相反.

胞外DNA；胞內DNA；染色體DNA；質粒DNA；提取方法

Received 13 December 2009 accepted 10 January 2010

Abstract：In this paper,effective methods were presented to extract different gene types（extracellular DNA,intracellular DNA,genome DNA and plasmid DNA）from the sediments and water in environment.The methods were used for extracted extracellular DNA and intracellular DNA in sediments while genome DNA and plasmid DNA of bacteria in water in typical regions of Haihe River.Results showed that extracellular DNA was more than 1kb in size;its recovery ratio was 46%～72%without containing intracellular DNA by using NaH2PO4.All intracellular DNA were more than 23.1kb in size.Genome DNA and plasmid DNA were separated simultaneously.PCR amplification of 16S rDNA and sul2 were applied for assurance of the methods.Results showed that products of 16S rDNA of all the extracellular were negative while intracellular DNA positive.The genome DNA amplified of 16S rDNA turned out to be positive while of sul2 was negative,the results of plasmid DNA were the opposite.

Keywords：extracellular DNA；intracellular DNA；genome DNA；plasmid DNA；extraction

1 引言（Introduction）

近年來，抗生素的濫用導致在動物腸道細菌誘導產生抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes, ARGs），抗性基因從動物腸道細菌向環境土著細菌傳播擴散，使其成為一類新型環境污染物，其在不同環境介質中的傳播擴散目前已引起廣泛關注（Knapp et al.,2008;Krumperman,1983;Nielsen et al.,1998;2007;Pei et al.,2006;Pruden et al., 2006;羅義等，2008;高盼盼等，2009）.現代分子生物學PCR技術已被越來越多地用于環境樣本中抗性基因的檢測，如何獲得高質量的DNA模板是進行PCR擴增的前提.目前采用的環境樣本DNA的提取方法大都建立在對細胞內 DNA的提取上（Volossiouk et al.,1995;Clesceri et al.,1995）.然而，無論在陸地生態系統還是水生態系統都已檢測到胞外游離DNA的存在（Zhu,2006;Gallori et al.,1994;Poté et al.,2003）.許多研究表明，環境中包含持久性存在的游離態DNA.這些胞外DNA可以吸附在底泥和土壤的復雜顆粒物上，減少與脫氧核糖核酸酶接觸而避免降解（Niemeyer and Gessler,2002）.Romanowski等（1991）在土壤中加入質粒DNA，在60d后仍能檢測到其存在.研究表明，細胞外游離態的DNA分子同樣可以作為抗性基因的攜帶者，可通過與環境中的細菌接觸發生基因水平擴散從而將抗性基因整合或轉導進入其它微生物體內（Paget and Simonet,1994），使得這些菌體獲得抗性.因此，在抗生素抗性基因的研究中需要重視對環境中胞外游離態DNA的研究.

本文旨在建立一種可靠的河流底泥中胞外DNA的提取方法，并與胞內DNA提取方法相結合，同時分別提取河流水體中細菌體內的染色體DNA和質粒DNA.并將此方法應用于海河底泥和表層水體不同形態DNA的提取，為進一步研究海河水體中抗性基因的主要存在形態提供可行性.

2 材料與方法（Material and methods）

2.1 采樣點選取

海河是中國北方重要水系，全長73公里，從西向東流經整個天津.本研究選取海河支干流5個代表性采樣點：1）大沽橋：干流，位于天津的幾何中心的商業娛樂區；2）洪泥河：支流，處于農業區；3）新開河：支流，城市泄洪與排澇；4）馬廠減河：農業灌溉與城市排澇；5）入海口：海河的終點，流入渤海.采集的樣品對分析對比不同樣點的DNA形態有較好的代表性.

具體采樣布點見圖1.

圖1 海河采樣點Fig.1 Sampling sites of the Haihe River

2.2 樣品采集

采樣在2008年12月進行.采集海河表層底泥（0～20cm），水樣在底泥的垂直高度上采集，采集表層水樣（0.5m），記錄水溫.采集的底泥樣品轉移到無菌塑料袋中，水樣收集到無菌塑料瓶中，4℃條件下立即運送回實驗室，24h內分析.

2.3 底泥胞外DNA和胞內DNA提取

2.3.1 胞外DNA提取

1g底泥，放入10mL滅菌塑料試管，分別加入4mL NaH2PO4（0.12mol·L-1,pH 8.0） 和 100μL sodium dodecyl sulphate（SDS,10%）混勻，250r·min-125℃振蕩10min；添加0.2g polyethylene poly pyrrolidone（PVPP） 混勻，4℃、6000r·min-1離心10min，0.22μm滅菌膜（Osmonics,USA）過濾，上清液收集到另一個試管A中至于冰上.離心后的沉淀再加4mL NaH2PO4，250r·min-125℃振蕩5min，離心（條件同上）再收集上清液到A中；同上再提取1次.提取得到的上清液放置冰上，下一步提純（Corinaldesi et al.,2005;Ogram et al.,1987）.

2.3.2 胞內DNA提取

上述離心后的沉淀和過濾后膜的截留物用于提取胞內DNA，采用SDS高鹽法，并做適當修改.沉淀和剪碎的濾膜加入 4mL DNA提取液（100mmol·L-1Tris-HCl,100mmol·L-1Na2-EDTA, 100mmol·L-1Na3PO4,1.5mol·L-1NaCl,1%CTAB, 50mg·mL-1protein K）和 0.5g 1mm玻璃珠（酸洗），2500r·min-1振蕩10min；加入1mL SDS（10%）混勻，液氮放置1min后立即60℃水浴20min，重復3次，4℃、8000r·min-1離心20min，上清液轉移到試管B中冰上放置.沉淀再次加入2mL DNA提取液，2500r·min-1振蕩 5min，37℃水浴 2h，加入1mL SDS,60℃水浴20min，4℃、8000r·min-1離心20min.收集上清液到試管B，放置冰上，下一步提純.

2.3.3 胞外DNA提取率

1g底泥樣品在馬弗爐450℃下烘烤2h，加入15μg的E.coli BH5α DNA，用上述的胞外DNA提取方法提取.

2.3.4 方法質量控制

驗證胞外 DNA提取方法是否共提取胞內DNA.將過夜培養的 2mL菌液（E.coli BH5α，OD600=0.35）離心，加入DNase I（10mg·mL-1）37℃溫浴15min（去除胞外DNA影響），過0.22μm滅菌膜，NaCl（1.5mol·L-1）溶液去除DNase殘留.過濾后的膜與經過預處理的底泥樣品（馬弗爐450℃，2h）混合.用上述胞外DNA提取方法提取.提取物經16S rDNA PCR擴增.

2.4 水體細菌中質粒DNA和染色體DNA提取

2.4.1 水體中菌體收集

1L水樣過0.22μm滅菌膜（Osmonics,USA），100mL溶液（0.25mol·L-1KH2PO4,0.75mol·L-1MgCl2）（Clesceri et al.,1995）沖洗兩次.膜剪切成碎片放進 15mL離心管，加入 1.8mL SET溶液（20% sucrose,50mmol·L-1Tris-HCl,pH 7.6）（Rivera et al.,2003;Sommerville et al.,1989）.

2.4.2 水體中菌體總DNA提取

6000r·min-1離心10min，棄去上清液；250μL溶液Ⅰ（50mmol·L-1sucrose,25mmol·L-1Tris-HCl,10mmol·L-1EDTA,RNase 1mg·mL-1,pH 8.0）重懸菌體，混勻；加入250μL溶液Ⅱ（0.2mol·L-1NaOH和1%SDS）混勻，至于冰上2min；加入250μL KAc（5mol·L-1,pH 4.8），加入的動作要快且柔和.混合液置于冰上5min，4℃、12000r·min-1離心10min.

2.4.3 質粒DNA和染色體DNA分離

上清液含有質粒DNA，沉淀中含有染色體DNA.將上清液轉移到另外的試管中.沉淀加入2mL NaCl溶液（1.5mol·L-1），重懸沉淀.

2.4.4 方法質量控制

同樣方法提取過夜培養的2mL菌液（E.coli BH5α，OD600=0.35）質粒DNA和染色體DNA，作為方法質量控制.提取物經16S rDNA和sul2 PCR擴增.

2.5 純化

提取DNA使用 DNA純化試劑盒（3S Spin Agarose Gel DNA Purifiction Kit Shenergy Biocolor, China）純化.所有的提取物保存在-20℃.

2.6 16S rDNA和sul2擴增

16S rDNA擴增應用于胞外DNA提取質量控制（檢驗是否共提取了胞內DNA），采樣點底泥胞外DNA和胞內DNA（提取方法應用性），水體染色體DNA和質粒DNA（提取方法的應用性和分離驗證）及E.coli BH5α（分離驗證）PCR擴增.sul2擴增應用在E.coli BH5α（分離驗證）水體染色體DNA和質粒DNA（分離驗證）.

表1 DNA擴增引物Table 1 Primers of amplification

PCR擴增引物見表1.使用 Biometra PCR（Biometra TGradient,Germany）擴增儀.反應體系溶液包含：12.5μL 2×Taq PCR預混液［（0.1U·μL-1Taq polymerase,0.5mmol·L-1dNTP（dATP,dCTP, dGTP,dTTP）,3mmol·L-1MgCl2,100mmol·L-1KCl,20mmol·L-1Tris-HCl,pH 8.3）］和其他的穩定劑（Tiangen biotech Ltd.,Beijing,China），0.5μL引物（1μmol·L-1），1μg DNA模板，加dd H2O到最終體積25μL.PCR反應條件：（1）16 S rDNA：95℃預熱 5min，95℃、15s 30個循環，56℃退火 30s，72℃延長1min，最后72℃ 5min；陽性對照大腸桿菌提取的基因組DNA代替模板；（2）sul2：95℃預熱 5min，95℃、15s 30個循環，60.8℃退火 30s，72℃延長1min，最后72℃、5min，陽性對照是E. coli BH5α提取的質粒代替模板.陰性對照是將模板由無菌水代替，其余不變.

3 結果與分析（Results and analysis）

3.1 DNA的純度與濃度表征

使用紫外分光光度法測定 DNA溶液在230nm、260nm、280nm的光度值.DNA純度依據OD260/280和OD260/230比值，比值越大說明DNA樣品中蛋白質和腐殖酸雜質的含量越低，DNA樣品越純，反之亦然（Steffen et al.,1988）.實驗提取的DNA溶液OD260/280皆在1.8左右，OD260/230在2.0左右，表明提取物DNA純度較好，不含PCR反應的抑制劑，達到PCR擴增要求.

底泥DNA濃度：OD260×50μg·mL-1×稀釋倍數× DNA溶液體積（mL）/底泥重量（g）；水體DNA濃度：OD260×50μg·mL-1×稀釋倍數×DNA溶液體積（mL）/水體體積（L）.

電泳：PCR產物（5μL）1.2%凝膠，DNA提取物（5μL）0.7%凝膠電泳，λDNA/HindⅢ與Marker 1作為分子標準.凝膠經EB染色，凝膠成像系統分析.

3.2 DNA提取方法質量控制

底泥中胞外DNA的提取應滿足：1.溶液能最大限度的溶解底泥中的DNA；2.不能提取出胞內DNA；3.提取DNA的純度要達到后即的分子實驗要求.很多其他的因素，比如DNA吸附在土壤底泥顆粒物上，共提取的酶抑制劑和DNA的降解或剪切都可能影響DNA的提取效率（Corinaldesi et al.,2005）.針對胞內DNA的提取方法的評判是：1.分子量大且完整（＞23kb）；2.沒有分子分析抑制物（OD260/280），必須適用于樣品分析和后繼的DNA擴增.

方法質量控制結果，胞外DNA經16S rDNA電泳未出現條帶，提取溶液中未含有胞內DNA，說明建立的胞外 DNA提取方法可靠.底泥提取DNA經16S rDNA PCR擴增后，所有的胞外DNA擴增產物呈陰性，胞內DNA呈陽性（圖2）.提取物不經稀釋即可使用.試驗數據和PCR結果表明上述的提取方法適用于不同區域底泥的胞外胞內DNA提取，而且可以用于后繼的分子分析，方法簡易可行.

在堿性條件下大分子的線性染色體DNA彼此聯結形成網狀結構，與細胞膜、蛋白等形成共沉淀，共價閉合環狀的質粒DNA仍然懸浮在上清液中，通過離心分離質粒DNA與染色體DNA.

驗證同時提取染色體DNA和質粒DNA的方法.在方法質量控制中，利用建立的方法提取已知標準菌（構建含有 sul2抗性基因質粒的 E.coli BH5α）染色體DNA和質粒DNA.質粒DNA包括環狀質粒DNA和開環線狀質粒DNA.本實驗提取的環狀質粒DNA多于開環質粒DNA，根據圖中泳帶亮度可得，提取比例大約是3：1到4：1（圖3）.實驗中發現，NaOH是實驗中細胞膜裂解的關鍵. Frerix等（2007）表明NaOH濃度影響質粒DNA和染色體DNA的獲得量.時間和動作劇烈程度對提取很重要，一旦染色體DNA在裂解中斷裂，不會在中和條件下沉淀.經16S rDNA和sul2 PCR擴增發現，染色體DNA的16S rDNA結果全部陽性而sul2呈陰性，證明提取的染色體DNA沒有包含質粒DNA；質粒DNA的16S rDNA結果呈陰性而sul2的 PCR結果呈陽性，證明沒有參雜染色體DNA.

采樣點水體中菌體提取的質粒DNA和染色體DNA全部進行16S rDNA和sul2的PCR擴增.染色體DNA的16S rDNA結果全部陽性而sul2呈陰性，證明提取的染色體DNA沒有包含質粒DNA；質粒DNA的16S rDNA結果呈陰性而sul2的PCR結果呈陽性，證明沒有參雜染色體DNA（圖4）.該方法表明同時提取染色體DNA和質粒DNA的方法可以應用在環境樣品的提取過程，而且在分子分析中可以直接使用.

3.3 海河底泥中胞外DNA和胞內DNA濃度

胞外DNA提取率的分光值表明不同的底泥樣品的提取率為40%～72%，與Corinaldesi等（2005）從海洋底泥中提取胞外DNA的提取率34%～60%接近，Corinaldesi等（2005）同時發現胞外 DNA的含量是胞內DNA的10～70倍.本研究結果表明，海河底泥5個采樣點都存在相當濃度的游離態胞外DNA，其濃度明顯高于胞內DNA（圖5）.不同區域的胞外DNA含量不同，大沽橋>馬廠減河、洪泥河>新開河、海河入海口.本研究對5個樣點底泥的統計分析表明（SPSS），海河底泥胞外DNA濃度與底泥中的黏粒含量有很好的相關性（r=0.979, p=0.01），這與底泥黏粒對DNA的吸附提供保護、減少核酸酶降解密切相關.電泳圖分子量大小表明提取的胞外DNA大于1kb（圖6）.5個采樣點底泥中胞內DNA含量不同，馬廠減河、洪泥河>大沽橋>新開河>海河入海口（圖5），提取物均大于23.1kb，提取過程無明顯降解和剪切現象（圖6）.本研究表明底泥中存在的胞外DNA形態占很重要的比例，在研究中這部分形態的DNA不能忽視.

3.4 海河水體中染色體DNA和質粒DNA濃度

從5個采樣點水體中菌體的染色體DNA和質粒DNA結果中發現大部分都以染色體DNA形態存在（圖7）.提取的水體菌體染色體DNA含量和質粒DNA含量均以洪泥河樣品最高，其他各區域差異不大.

圖7 海河水體中提取DNA濃度Fig.7 The concentration of DNA extraction in water of Haihe River

不同形態DNA提取的細化在研究中是非常必要的.Potè等（2003）和Agnelli等（2004）發現胞外DNA遷移性很強，可從土壤的上層遷移到底層.如果這些胞外DNA攜帶有致病基因并遷移到地下水中，將對人類健康造成最直接的威脅.如果攜帶抗性基因的胞外DNA轉移到土著微生物體內，將直接影響環境中微生物群落的進化及生物種群多樣性（Lorenz and Wackernagel,1994）.同時質粒DNA與染色體DNA的分離，對定位環境中功能基因的研究，闡述基因分布、傳播有很大的幫助.

本研究提出了從環境樣本同時提取不同形態DNA的方法，是進一步細化分子生物研究有效的DNA提取方法，該方法對于進一步研究抗生素抗性基因在環境中的主要存在形態提供了有效的方法學支持.

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Methods of Extraction Different Gene Types of Sediments and Water for PCR Amplification

FENG Ling，LUO Yi*

Key Laboratory of Pollution Processes and Environmental Criteria,Ministry of Education,College of Environmental Sciences and Engineering,Nankai University,Tianjin 300071

1673-5897（2010）2-280-07

X502

A

羅義（1971—），女，南開大學副教授，碩士研究生導師，主要從事污染生態化學、分子生態毒理、分子生物標記等方面的研究.

2009-12-13 錄用日期：2010-01-10

國家自然科學基金（No.2077704;No.30870363）；天津市自然科學基金（No.08JCYBJC02700）

馮凌（1984—），女，碩士研究生；*通訊作者（Corresponding author），E-mail:luoy@nankai.edu.cn