大鼠結腸黏膜電切術后抗菌治療對局部組織修復的影響

譚 瑩 ，譚慶華

（1.廣東省深圳市觀瀾人民醫院內二科，廣東深圳 518000；2.貴陽醫學院附屬醫院消化內鏡科，貴州貴陽 550004）

隨著內鏡微創技術的進步，對某些胃腸道黏膜病變及黏膜下表淺病變，可行內鏡下電切術，完全摘除病變[1]。術后局部隨即形成潰瘍，當潰瘍完全愈合后，才真正達到臨床治愈的目的。 結締組織生長因子（connective tissuegrowth factor，CTGF）具有促進細胞增殖、合成膠原等諸多生理作用[2]；而表皮生長因子與其受體（epidermalgrowth factor receptor，EGF-R）結合形成二聚體，啟動相應的信號轉導通路，促進細胞有絲分裂，促進損傷組織的修復[2]。電切術后的一段時間內，臨床上常經驗性給予抗菌治療以減少術后創面感染的發生。但常規使用抗生素是否有利于黏膜創面的修復？本文觀察大鼠結腸黏膜電切術后創面自然愈合的過程及抗菌治療過程中CTGF和ERF-R的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選用成年的健康SD大鼠共48只（貴州省貴陽醫學院實驗動物中心），雌雄各半，體重（200±13）g。飼養標準棒狀飼料，自由飲水，室溫（23±2）℃，實驗前適應性喂養1周。平均隨機分為4組:①正常組；②手術未治療組；③手術治療組；④假手術組。

1.2 動物模型

術前24 h禁食，8 h禁飲。腹腔內注射麻醉劑（10%水合氯醛3～6 ml/kg）后，無菌操作下取下腹正中切口入腹腔，將膨大的盲腸部鉗拉出腹腔外，在盲腸遠端的結腸側切開腸管，切口長約5 mm，在距切口約5 mm處的結腸黏膜下注射生理鹽水至黏膜隆起，用單極電刀（CHR-ⅢE型，武漢春光醫療美容儀器有限公司，中國）電切隆起的結腸黏膜大小約3 mm×3 mm。關閉腸管、腹腔、消毒、包扎，所有動物術后禁食、禁水24 h。假手術組只切開腸管，不行黏膜電切術，其余同手術治療組。

1.3 動物給藥

手術治療組用0.08%的鹽酸左氧氟沙星[0.018g/（kg·d），國藥準字H19990324，揚子江藥業集團有限公司，中國]和0.92%的甲硝唑[0.047g/（kg·d），國藥準字 H10930165，山西仟源制藥有限公司，中國]腹腔內注射，分組持續注射至術后第4、7、12天；手術未治療組、假手術組均采用等劑量的生理鹽水腹腔注射；正常組予以常規飼養，不予以腹腔注射給藥。各組其余實驗條件相同，于相應時間用離斷頸椎法處死大鼠，留取電切術局部腸管，正常組和假手術組留取相應部位的腸管，用10%中性福爾馬林液固定24 h后常規石蠟包埋、切片備用。

1.4 免疫組化法檢測CTGF、EGF-R（SABC 法）

用煮沸法修復抗原，修復液為0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液（pH=6.0）。 一抗分別為 Rabbit Anti-CTGF、Rabbit Anti-EGFR（武漢博士德生物工程有限公司，中國），1∶100稀釋。生物素化二抗為兔抗大鼠IgG（武漢博士德生物工程有限公司，中國），DAB顯色試劑盒（AR1022，北京中杉金橋生物技術有限公司，中國）室溫顯色20 min后，蒸餾水洗滌以終止反應，蘇木素輕度復染1 min，水洗，脫水、透明、中性樹膠封片觀察。各組設陰性對照。

1.5 結腸黏膜CTGF和EGF-R 的半定量測定

各組大鼠腸壁組織經免疫組化染色后于400倍光鏡下，對每張切片隨機選擇5個視野照像后，用圖像分析法測定每個視野中CTGF、EGF-R的積分光密度值（IOD），取其平均值作為每張切片的CTGF、EGF-R的IOD值。

1.6 數據統計

2 結果

2.1 各組動物結腸組織中CTGF 的測定

在正常組大鼠中，CTGF陽性染色主要在結腸黏膜層單層柱狀上皮細胞的胞漿中，呈弱陽性，主要集中在大腸腺體的頂端，其基底部幾乎為陰性。手術未治療組和假手術組除了上述部位陽性染色外，黏膜下層的結締組織的成纖維細胞胞漿也出現陽性染色。經鹽酸左氧氟沙星及甲硝唑聯合給藥治療后，CTGF陽性染色出現在黏膜層單層柱狀上皮細胞的胞漿和黏膜下層的結締組織的成纖維細胞胞漿中，且染色強度明顯高于假手術組及手術未治療組，見圖1。

在同一時間點上的不同組間相比，術后第4天手術治療組的IOD值較正常組、手術未治療組、假手術組都明顯升高（P＜0.05）。術后第12天假手術組和手術未治療組的IOD值較正常組明顯升高（P＜0.05），且手術未治療組又明顯高于假手術組（P＜0.05），見表1。

在同一組內的不同時間相比，正常組的IOD值各時間點之間無明顯差異（P＞0.05）。手術未治療組和假手術組均在術后第12天達最大值，明顯高于術后第4天和第7天 （P＜0.05）。 手術治療組在術后4d達最大值（P＜0.05），第7天降至正常水平，與正常組無顯著性差異（P＞0.05）。同組內第7天和第12天相比無顯著性差異（P＞0.05）。見表1。

2.2 各組動物結腸組織中EGF-R 的測定

在正常組大鼠中，EGF-R陽性表達主要位于結腸黏膜層單層柱狀上皮細胞的胞漿中，呈弱陽性染色。手術治療組、手術未治療組及假手術組EGF-R主要表達在局部組織的黏膜層單層柱狀上皮細胞、杯狀細胞的胞漿及黏膜下層的血管內皮細胞胞漿中。其中手術治療組的染色強度較正常組、假手術組及手術未治療組明顯增強。見圖2。

在同一時間點上的不同組間比較，術后第4天手術治療組的IOD值較正常組、手術未治療組、假手術組都明顯升高(P＜0.05)；手術治療組術后第7天仍明顯高于其他各組 (P＜0.05)，到術后第12天回落至正常組水平(P＞0.05)。術后第12天假手術組和手術未治療組的IOD值較正常組明顯升高 (P＜0.05)，且手術未治療組又明顯高于假手術組(P＜0.05)，術后第4、7天的假手術組、手術未治療組與正常組無顯著性差異(P＞0.05)，見表2。

表1 CTGF在各組大鼠結腸組織中陽性染色的IOD（±s）Tab.1 IOD of CTGF positive stain in tissue of rat colon(±s)

表1 CTGF在各組大鼠結腸組織中陽性染色的IOD（±s）Tab.1 IOD of CTGF positive stain in tissue of rat colon(±s)

與正常組比較，*P＜0.05；術后第4天手術治療組與正常組、手術未治療組及假手術組相比，△P＜0.05；術后第12天假手術組及手術未治療組與正常組比較，▲P＜0.05；同組內與其他兩個時間點相比，▼P＜0.05Compared with normal controlgroup,*P＜0.05;compared with shamgroup and untreatedgroup on the 4thday,△P＜0.05;compared with normal controlgroup and untreatedgroup on the 12thday,▲P＜0.05;compared with others time point in a samegroup,▼P＜0.05

組別例數12 12 12 12正常組假手術組手術未治療組手術治療組第4天2 072.05±678.01 1 269.85±259.56▼1 136.90±439.74*▼2 838.54±931.23*△▼第7天1 647.27±462.78 1 407.62±331.47 1 752.45±603.75*1 245.65±327.55*第12天1 680.79±670.96 2 452.44±831.12▲3 912.71±1214.67*▲1 058.69±440.29*

在同一組內的不同時間相比，正常組的IOD值各時間點之間無顯著性差異(P＞0.05)。經聯合給藥后，手術治療組的IOD值在術后第4天達高峰，較同組內第7天和第12天明顯升高 (P＜0.05)，術后第7天又高于術后第12天 (P＜0.05)。手術未治療組和假手術組的IOD值均在術后第12天達最大值，均較同組內第4天和第7天明顯增加(P＜0.05)。見表2。

3 討論

內鏡下黏膜切除術（endoscopic mucosal resection,EMR）和內鏡黏膜下剝離術（endoscopic submucosaldissection,ESD）已成為消化道癌前病變和早期癌的重要治療手段[1-3]。而術后暴露于腸內容物的創面，可能繼發感染，延遲其愈合，所以術后臨床上常給予抗生素治療。

在切除病變的局部將形成黏膜及黏膜下組織的缺損，而創面愈合涉及到壞死物質的清除、基底部肉芽組織的生長、纖維組織和瘢痕組織的生長、新生血管的生成、單層柱狀上皮的長入、上皮的重構等過程。在這一過程當中會有包括CTGF和EGF等一系列的細胞因子參與[3-4]。

表2 EGF-R在各組大鼠結腸組織中陽性染色的IOD（±s）Tab.2 IOD of EGF-R positive stain in tissue of rat colon(±s)

表2 EGF-R在各組大鼠結腸組織中陽性染色的IOD（±s）Tab.2 IOD of EGF-R positive stain in tissue of rat colon(±s)

與正常組比較，*P＜0.05；術后第4天及第7天手術治療組與正常組、手術未治療組及假手術組相比，△P＜0.05；術后12天假手術組和手術未治療組與正常組比較，▲P＜0.05；同組內與其他2個時間點相比，▼P＜0.05compared with normal controlgroup,*P＜0.05;compared with untreatedgroup and shamgroup on the 4thday and 7thday,△P＜0.05;compared with normal controlgroup on the 12thday,▲P＜0.05;compared with others time point in a samegroup,▼P＜0.05

組別例數12 12 12 12正常組假手術組手術未治療組手術治療組第4天103.84 ±36.48 97.33 ±23.32 105.27 ±79.61*314.71 ±128.37*△▼第7天100.53 ±46.79 129.99 ±86.16 120.41 ±75.54*218.27 ±110.80*△第12天65.94 ±20.47 154.03 ±70.10▲▼304.86 ±128.40*▲▼111.22 ±86.38*

CTGF可刺激成纖維細胞增殖和細胞外基質（extracellular matrix，ECM）生成，參與機體組織的創傷修復及器官纖維化形成的過程[2]。本實驗結果顯示，正常組的CTGF陽性染色主要在結腸黏膜層單層柱狀上皮細胞的胞漿中，呈弱陽性表達，且主要集中在大腸腺體的頂端,而在基底部幾乎為陰性。這說明少量的黏膜淺層單層柱狀上皮細胞分泌的CTGF即可以確保腸壁內結締組織的生理性更新，使得結締組織中的相關成分處于一種動態平衡狀態，而且這一生理過程主要由黏膜淺層的上皮細胞參與調節。

CTGF不僅促進潰瘍修復過程中的纖維化過程，而且在瘢痕組織的重建或改建過程中起著更重要的調節作用，這種調節作用由潰瘍及周邊結締組織中的CTGF和黏膜層單層柱狀上皮細胞中的CTGF協同完成。其機制可能是一方面通過誘導成纖維細胞的增殖和細胞外的合成，介導細胞黏附，刺激細胞遷移，參與結締組織的再生、肉芽組織的形成。另一方面通過誘導血管內皮細胞的增殖，促進微血管的形成，參與結構的重建[5]。手術治療組、手術未治療組和假手術組在黏膜層柱狀上皮細胞的胞漿和黏膜下層結締組織中明顯增強的CTGF染色表明，CTGF可能通過誘導成纖維細胞的增殖和細胞外基質的合成，參與結締組織的再生、肉芽組織的形成和機化。

通過對CTGF的IOD值分析發現，假手術組和手術未治療組的結腸黏膜電切損傷后，在不做其他任何處理的情況下，術后7d內對上皮細胞合成和分泌CTGF無明顯影響。而在術后12d手術造成的創傷可能引起了機體自身修復反應的增強，此時CTGF分泌的增高是調節創傷修復的重要環節，這種反應使得上皮細胞合成和分泌CTGF的功能在第12天變得最強。術后第12天手術未治療組CTGF值較同時間的假手術組明顯增高，充分說明了額外的黏膜電切損傷，明顯增強了上皮細胞合成和分泌CTGF的功能，黏膜電切這一有效而確定的損傷和刺激引起了機體相應的修復反應。

相對于正常組、假手術組和手術未治療組而言，手術治療組CTGF值的明顯升高和其峰值的前移 （術后第4天）說明，鹽酸左氧氟沙星及甲硝唑的干預，使得與CTGF相關的機體修復反應明顯提前到術后第4天，這可能與這兩種抗生素的抗菌效應所形成的一個腸道近于無菌的環境，增強了這一代償、修復機制有關，即在抗菌治療后，黏膜創面的感染減輕，由此出現的較輕炎癥反應以及較少的炎癥介質的釋放，減輕了黏膜的損傷，更有利于上皮的增生和修復。

表皮生長因子（epidermalgrowth factor，EGF）主要由頜下腺及十二指腸Brunner腺分泌。在生理情況下，EGF由唾液直接進入消化道或由十二指腸Brunner腺直接分泌入小腸而發揮其對消化道黏膜的生物效應。在胃腸道的任何部位如果形成潰瘍，能誘導干細胞形成新的EGF分泌細胞體系，分泌大量EGF，從而刺激細胞增殖、再生，修復潰瘍[10]。EGF必須與細胞膜表面的表皮生長因子受體 （epidermalgrowth factor receptor，EGFR）結合才能發揮其生物學作用，促進上皮細胞、間質細胞的生長，增加黏膜細胞DNA、RNA和蛋白質合成，增加黏膜血流，促進黏液分泌，刺激組織生長修復，保護胃腸黏膜，促進急慢性損傷的愈合等[6]。

在正常組大鼠的結腸黏膜上皮細胞中EGF-R的弱陽性染色，可能是大鼠腸黏膜上皮細胞的生理性更新，維持腸黏膜正常的完整性和腸黏膜上皮細胞正常的吸收功能所必需的。從各組動物的結果顯示，EGF-R陽性表達主要位于結腸黏膜層單層柱狀上皮細胞的胞漿中，看來無論是結腸黏膜生理性更新，還是外源性損傷后的修復，對結腸黏膜組織中與EGF-R相關的修復反應，其黏膜淺層的上皮細胞應該起到最重要的作用。

有研究發現，EGF腔內應用可誘導小腸黏液杯狀細胞分泌黏液，保護鼠腸黏膜免受油酸誘導的損傷[7]。手術治療組、手術未治療組及假手術組的EGF-R主要表達在潰瘍局部組織的黏膜層單層柱狀上皮細胞、杯狀細胞及黏膜下層的血管內皮細胞胞漿中，且染色明顯加深。由于EGF-R參與調節正常上皮細胞的分化、增殖、上皮細胞間黏附及接觸抑制，當上皮細胞更新旺時，EGF-R表達增加，而當創傷被修復或上皮細胞的更新完成后，其表達明顯降低[6]，這可能是術后手術治療組、手術未治療組和假手術組的EGF-R明顯升高的原因。說明電切術后增加的EGF-R可能促進了杯狀細胞分泌黏液，促進新生血管的形成，增加黏膜血流量，刺激組織生長及修復，從而加快了潰瘍的愈合，維持了結腸黏膜的完整性。

假手術組和手術未治療組的EGF-R值在術后第4、7天沒有明顯的變化，而在術后第12天達到高峰，說明手術創傷可引起EGF-R表達的增加，其引起的機體自身修復反應在7d內無明顯變化，12d時變化最明顯。從結果看，可能是黏膜電切術引起了更強的自身修復反應，所以假手術組和手術未治療組的EGF-R值雖然均在術后第12天達最高峰，但手術未治療組卻較假手術組明顯升高。

同CTGF的變化相似，在手術治療組術后第4天EGF-R值增加達最高峰；不同的是術后第7天雖有下降趨勢，但仍明顯高于同時間的其他各組，直至術后第12天才慢慢回落至正常水平。這說明抗菌治療在抑制炎癥反應、減少炎癥因子的釋放、保護黏膜免受損傷的同時[8]，不僅可使創傷部位結締組織的修復反應提前，也可使上皮組織的修復明顯提前。由于EGF-R的高表達，促進了結腸黏膜上皮細胞的增殖和再生，減輕炎癥損傷，同時增加黏膜杯狀細胞合成和分泌黏液，加快了潰瘍愈合[9]。到術后第12天，上皮組織的這種修復反應在潰瘍表面得以初步修復后，EGF-R的合成和分泌才通過一定的機制回落到正常生理狀態時的水平。

潰瘍的愈合包括上皮、細胞外基質、黏膜上層和更深層組織的重建，是一個上皮細胞增殖、遷移和結締組織填補黏膜缺損的主動過程。腸黏膜上皮損傷的修復需要黏膜重建和再生。重建可能是早期黏膜修復的一個關鍵步驟，其重要過程是細胞遷移即從損傷周圍完好的上皮細胞移行覆蓋到鄰近的損傷表面，重塑黏膜屏障的完整性。再生過程包括增殖和分化[10]。本實驗結果顯示，在手術治療組中CTGF和EGF-R的表達高峰均在術后第4天。在術后第7天，CTGF恢復到正常水平，而EGF-R仍明顯高于正常組，此說明在給藥后，腸黏膜損傷后的修復，無論是結締組織修復的相關反應，還是上皮組織修復的相關反應，都在術后第4天最明顯。

綜上所述，大鼠結腸黏膜電切術后，機體自身的黏膜修復反應可能在術后第7天內無明顯反應，術后第12天變得最明顯。在給予鹽酸左氧氟沙星及甲硝唑治療后，結腸黏膜損傷后的結締組織修復和上皮組織修復都在術后第4天最明顯。隨著CTGF的明顯下降，結締組織修復已基本完成，而上皮組織修復仍然很明顯。給藥后可使修復反應的時間提前，且作用明顯增強，有助于創面的愈合，但最佳用藥時間長短仍有待于進一步研究證實。

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